大肠菌群快速检测方法研究进展

蔡尽忠

（厦门华厦职业学院，福建厦门361024）

1 引言

大肠菌群为一群在37℃、24h能发酵乳糖，产酸、产气，需氧和兼性厌氧的革兰阴性无芽胞杆菌的统称[1]。这些细菌多存在于温血动物粪便中，人、畜粪便对外界环境的污染是大肠菌群在自然界存在的主要原因。因此，大肠菌群被国际上公认为检测各种水质、医药及食品在流行病学上安全性的指示菌[2,3]。如果检测到大肠菌群呈阳性结果，那么便表明食品、药品或者水质存在大肠菌群，已经被粪便污染。大肠菌群的数量与受到的污染程度成正比，数量越多，受污染越严重。目前我国国家标准主要用多管发酵法来检测大肠菌群，多管发酵法作为一种传统的检测方法已沿用多年，其准确性、权威性无可质疑，但该方法费时费力，而且检测所需的费用较高，已无法满足人们对食品、药品安全现场监测的要求[4]，因此，现在食品、药品卫生监督检验迫切需要一种更加有效、快速的大肠菌群检测方法。近年来，世界各国针对大肠菌群的快速、定量检测技术都进行了专门的研究[5,6]，本文综述了大肠菌群快速检测技术的研究进展，并对其存在问题及应用前景进行分析。

2 大肠菌群主要的快速检测方法

2.1 免疫学技术

免疫学方法检测原理是依据抗原和抗体特异性反应[7]。目前用于大肠菌群的免疫学检测方法主要有酶联免疫吸附试验、荧光免疫检测、免疫磁珠技术[8]。

2.1.1酶联免疫吸附试验（ELISA）

ELISA的技术原理是：将酶分子与抗体（或抗原）结合，形成稳定的酶标抗体（或抗原）与固相载体上的相应抗原（或抗体）结合时，即可在底物溶液参与下，生成可溶性或不溶性有色物质，颜色的深浅与抗原或抗体的量成比例关系，结果可用肉眼或酶标测定仪判定。

1989年Obst 等[9]建立了使用识别肠道菌群共同抗原ECA的单克隆抗体检测肠道菌群的ELISA法，样品经增菌至105 cfu/ mL后可以检出目标菌。王玉金等[10]于2012年利用双抗体夹心法检测大肠杆菌O157:H7，结果得出大肠杆菌O157:H7的最低检出浓度为1×105cfu/mL，实验仅在10min内完成了检测。ELISA法具有快速、简便等优点，但是抗体的特异性、抗原与抗体的浓度和反应液常常会对结果产生影响。当对污染比较严重的样品进行检测时，ELISA法存在严重缺陷，主要是很可能受到其它存在的细菌的影响而降低方法的特异性。

2.1.2荧光免疫检测（FIA）

荧光免疫检测技术是将不影响抗原抗体活性的荧光素标记在抗原（或抗体）上，与其相应的抗体（或抗原）结合后，通过荧光分光光度计检测荧光强度，推算待测物质的浓度。1999年Rockabrand等[11]发明了一种革命性的FIA法，他们使用针对大肠杆菌不同生长周期胞浆中合成的特异性蛋白的单克隆抗体，用荧光物质标记这些单克隆抗体。

IFA是一种新兴的检测技术，由于大肠菌群的成员的复杂性，使用该技术进行实现对全

部大肠菌群的检测需要制备大量成员中不同菌种的单克隆或多克隆抗体，具有一定的困难性。而对于大肠杆菌的检测技术日趋成熟，但在提高抗体的特异性，避免其它细菌发生交叉感染方面还有待于进一步提高。

2.1.3免疫磁珠技术（IMB）

免疫磁珠技术应用磁珠作为抗体载体，通过抗体抗原结合在磁力作用下发生力学移动，而达到分离特异性抗原的目的[12]。磁性微球与微生物的特异性抗体产生偶联，再将微球加到待检测标本的液体中，相应微生物就会与抗体发生特异性结合，在磁场作用下，可将微生物从磁性微球上解离下来，进行 PCR 或荧光染色检验[13]。Martin等[14]应用此法从病人粪便中分离出多株山梨醇阳性O157:H7大肠杆菌。该方法特异性好、敏感度高，但操作复杂，不具备推广应用的能力。

免疫学方法的优点是高效，可在几个小时内出结果。缺点是由于其他微生物共同抗原的干扰，检测大肠菌群易出现假阳性，需要制备更高特异性的单克隆抗体或多克隆抗体，一旦菌体发生变异，检测结果就不准确，操作繁琐，成本昂贵。

2.2 酶学技术

与传统方法相比，微生物酶谱分析法具有特异性强、反应快速、敏感的优点。根据所检测酶类的不同，可以分辨出大肠菌群的群、属、种，反应也更加快速、敏感。其原理是培养基含有的荧光或显色底物在细菌特异性酶的作用下，产生荧光或显示一定颜色，一次完成目标菌的检测、计数和鉴定[15]。常用β-葡萄糖醛酸酶催化显色的底物有羟基吲哚-β-D 葡萄糖苷酸（IBDG）和半乳糖苷（X-Glu）；4-甲基伞形酮-β-D-半乳糖苷（MUG）为β-葡萄糖醛酸酶催化显现荧光的底物；5-溴-4-氯- 3-吲哚半乳糖苷（X-Glu）、邻硝基苯基-β-D-半乳糖苷（ONPG）和对硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷（PNPG）用于检测β-半乳糖苷酶的显色反应，而MUG用于检测β-半乳糖苷酶的荧光反应[16]。

酶活性检测法比传统方法省时省力（18～24h），而且特异性更高，已经被广泛应用于快速检测饮用水、食品中的大肠菌群。因其具有简单、快速、准确性高、二次污染小等优点，目前已经被许多国家写入国家标准。但是该法成本过高并且容易受到水中消毒剂、食品的处理过程以及培养基中存在的抑菌物质的影响，破坏了大肠菌群的正常生长，使其酶合成的能力下降，对检测结果产生影响，而且与传统方法一样不能解决无法培养的大肠菌群的检出难题。

2.3 分子生物学技术

大多数分子生物学方法不需要培养步骤，因此可以在几个小时内完成，目前常用的检测大肠菌群的分子生物学方法主要有原位杂交（ISH）技术和聚合酶链式反应（PCR）技术。

2.3.1原位杂交（ISH）法

原位杂交是将组织化学与分子杂交相融合的一种技术，利用合成的大肠菌群RNA或DNA序列互补的探针，与大肠菌群进行杂交，即在细胞、染色体及组织上检测特异的RNA或DNA序列，从而特异地检出大肠菌群。王建龙[17]采用荧光标记探针取代同位素探针的荧光原位杂交技术(FISH)，专门设计针对 16SrRNA 分子区域检测水样产品的大肠菌群检测探针，可在6～8h内给出定量分析结果。ISH 技术具有操作快速、简便、安全和稳定的优点，广泛应用于环境微生物检测，能进行定性和定量分析。

2.3.2聚合酶链式反应（PCR）法

聚合酶链反应技术是利用耐热DNA聚合酶的作用，通过变性-延伸-复性的循环操作，在体外迅速将 DNA 模板扩增数百万倍的一种克隆技术。王建龙[18]利用PCR技术扩增编码lacZ基因的DNA片段，可以检测大肠菌群。尽管PCR技术具有高敏感性和特异性，但由于食物组分中可能存在着多种酶的抑制剂，会影响 PCR 法的检出率，并且PCR法不能区分活菌和死菌，很难对大肠菌群进行定量分析。

2.3.3基因芯片技术

基因芯片技术今年来发展迅速，生命科学、计算机学和化学等多种学科被它联结起来，具有很强的交叉性，是当今的研究热点。基因芯片是把已经设计的基因片段或者寡核苷酸按照一定顺序紧密的排列在芯片上，荧光标记分子经过PCR扩增的方式进入微生物样品（大肠杆菌）的DNA，并且与芯片上的寡核酸点进行杂交，最后通过荧光波长扫描仪，利用计算机软件分析得到待测样品的含量。

目前基因芯片技术并未适合全部大肠菌群的检测，仅仅局限于大肠杆菌的测定。祝儒刚等[19]使用基因芯片技术对肉制品中的大肠埃希氏菌进行检测，过程中编码了大肠埃希氏菌的基因，选取16SrDNA基因作为阳性对照，经试验证明灵敏度低达2 pg。贺晨等[20]将该技术与多重PCR技术相联接，研究了一种检测11种致病菌的方法。对相应的引物与探针进行设计，进行多重PCR的扩增，制备芯片，将扩增产物与含有探针的基因芯片进行杂交，最终得到目标细菌的含量。结果表明对大肠杆菌的特异性检测灵敏度可以达到2×10-3ng。

基因芯片技术具有快捷、灵敏度高、操作方便等特点，逐渐成为热门研究领域。其最值得关注的一个优点是相对于传统的培养法无法识别死菌，而基因芯片技术可以将死菌的DNA识别出来。

2.4 传统检测方法改进技术

2.4.1膜过滤技术

大肠菌群通常菌体长2～3μm，宽 0.5～0.8μm，当用孔径为0.45μm 滤膜过滤时水可以通过，而大肠菌则被截留下来。然后把滤膜贴在选择性培养基中培养，计数膜上生长出的典型细菌菌落。膜过滤法已经被很多国家作为标准方法，主要应用于水质检测中，例如中国质量监督检验检疫局对入出境船舶压能水中的大肠菌群的检测，德国标准化学学会以及日本发布的标准都使用膜过滤法做为检测水中大肠杆菌和耐热大肠杆菌以及其它种类大肠菌群的标准方法。

膜过滤技术属于定量试验，其最大的优点是检测较大体积的水样时，检出的敏感度和可靠性较传统方法有明显提高；缺点是受水样中其他细菌干扰，特异性不高，易出现假阳性检测结果，需进一步验证试验才能最终确定，尤其当饮用水消毒处理后，会使其中的大肠菌群受到损伤，致使不能在选择性培养基中长出菌落，降低检测结果的准确度。

2.4.2快速测试片法

大肠菌群快速纸片法检测原理是将适量的乳糖、指示剂溴甲酚紫和 （TTC）菌体生长发育所需要的营养成分以及革兰氏阳性菌抑菌剂吸附于一定面积的无菌滤纸上，大肠菌群生长发酵乳糖产酸使pH值降低，溴甲酚紫指示剂由紫色变黄色，在纸片上呈现出黄色反应，同时菌体中含有的脱氢酶还原TTC形成红色不溶性红四氮唑，显出红色斑点[21]，以同时满足这两种特性作为阳性结果的唯一判定标准。

2.4.3Hygieut载片培养法

Hygieut载片培养法是一种结晶紫中性红胆盐琼脂载片，在一块带折页设计的塑料桨片上浇注适合于大肠菌群快速生长的琼脂培养基，样品表面能与培养基方便、充分地接触，载片上带有帽盖，可以使载片在无污染情况下放回到无菌培养管中进行转运和培养。大肠菌群能够分解琼脂载片上的乳糖产酸，产气并产生其他特征性的形态和颜色变化，从而通过目测，即可对大肠菌群菌落数进行定性或定量的快速检测。

2.4.4试剂盒法

试剂盒法是按照国家食品、水质标准检测方法-多管发酵方法研制而成。其原理是将液体乳糖培养基经固化加工后，置于特制透明塑料盒中，两者组成试剂盒。王世平等[22]根据国内外研究大肠菌群检测进展和研究成果，研发出大肠菌群快速检测试剂盒，现已批量生产，并于2006年获国家技术专利。试剂盒法操作简单快速、结果判定清晰准确、成本低廉，便于携带和保存。通过试验测试，证实试剂盒法与国标法检测结果无明显差异，是一种科学、实用、可靠的检测方法，适用于食品、水质大肠菌群的检测。

2.5 物理化学技术

2.5.1电阻抗法

电阻抗法检测大肠菌群的原理当大肠菌群在培养基内生长繁殖时，大肠菌群的新陈代谢作用导致培养基内营养成分发生变化，电惰性物质包括糖转化为乙酸、乳酸，蛋白质分解为氨基酸，脂肪转化为重碳酸盐，这时培养基中的电导性有所加强而电阻抗能力下降，因此可以知道通过测量培养基内电阻抗的改变即可获得大肠菌群的数量[23]。不同数量的大肠菌群呈现出不同的指数期，两者之间具有一定联系，确定这种联系后大肠菌群的数量便可通过记录电阻抗值获得。当样品中大肠菌数量较多时，3～4h即可获得阻抗信号，而当样品中大肠菌数为较少时获得信号需要较长时间，如果每毫升只有1个大肠菌群甚至需要10h。李小燕等[24]在进行牛奶中大肠菌群的测定时使用了电阻抗法，当每毫升牛奶中的大肠菌群数量达到十万个时，4h即可完成检测，与传统方法相比速度快且差异不显著。Martin等[24]将电阻抗法应用于肉制品中的大肠菌群的检测，Colquhoun等[25]将电阻抗法用于饮用水中大肠杆菌的检测，都得到了较佳的结果。J.Dupont[26]使用阻抗法检测海洋中贝类动物中大肠杆菌的数量，5～9h内即可得到测定结果。电阻抗法方便易行、耗时短并且可以连续对培养基中大肠菌群的生长状况进行测量。但该法的灵敏度会随待检样品中菌数浓度的高度而有所变化。当样品中大肠菌群污染量低时检出的时间较长，样品中菌量越高则检测时间越短，最低检测限较高。此外该法成本较高，需要特殊的流体与电热调节并且特异性和选择性也较差。

2.5.2生物传感器法

生物传感器的主要特征是对生物物质敏感，生物物质的浓度可以被相应的转化为电信号。生物传感器主要由以下三个部分组成：识别元件，主要包括抗体、抗原、酶、微生物、组织、细胞、核酸等生物活性物质；换能器，主要包括氧电极、场效应管、压电晶体、光敏管等还有信号方法装置。生物传感器具有简便、体积小、成本低、灵敏度高、专一性强及抗干扰能力强、响应快等优点, 目前其在食品安全检测中已经得到了广泛的应用[27]。张文浩等[28]研究的生物传感器主要基于表面等离子体共振原理，以酸菜发酵液为对象进行了大肠杆菌的检测，通过捕捉传感器的折射率建立方程，最终得到大肠杆菌的数量，该方法检出限能够达到104cfu/mL。

2.5.3化学发光法

日本的Susumu Kawasaki[29]使用化学发光法检测牛乳中的大肠菌群。主要原理是将大肠菌群接种到液体培养基中培养一段时间后添加醌类化合物（甲萘醌）时，醌类化合物作为氧化还原催化剂，使培养液中的氧还原，最终生成活性氧。同时，在这种含有活性氧的培养液中添加发光试剂（鲁米诺）时会产生化学发光，细胞活性就能被检测出来。梁玉冰[30]对大肠菌群数目与发酵液颜色之间的变化进行研究，分析了大肠菌群在发酵过程中颜色所发生的变化，与大肠菌群数量建立了关系模型，最终得到了快速计数大肠菌群的比色试纸。

2.6 其它技术

2.6.1全自动系统

法国梅里埃集团生产的全自动微生物检测系统（VITEKAMS）能够对细菌做出鉴定，做出鉴定的基础是每种细菌的微量生化反应。杨毓环等[31]使用VITEK-AMS系统对已知的金黄色葡萄球菌、大肠杆菌等标准菌株进行检测，结果与已知的全部符合。对肠科杆菌的鉴定与常规方法比较，符合率为95.06%。VITEK-AMS不同于以往的培养方法，而是将检测鉴定技术与现代计算机技术相结合，使检验工作实现了高效、快捷、自动、科技化，大大的提高了效率，减少了人力物力的浪费。

2.6.2ATP生物发光法

ATP生物发光技术是近年来被逐渐应用于快速检测中的一种新方法，在大肠菌群的检测中有着广泛应用。目前常用的方法是荧光素酶-ATP法，该方法是由McEloyr[32]出的，其原理是在ATP参与下，荧光素酶和氧气为反应基底物质，荧光素被氧化使得化学能变为光能，并释放光量子。每一分子的ATP都会产生一分子的光量子，发光强度与ATP的浓度呈正相关。使用光强度测量仪器侧得荧光强度即可得到ATP的浓度，而每个细胞的中的ATP含量几乎是一致，由此可推算出大肠菌群的数量。该方法的操作步骤主要分为[33]：样品的采集和ATP的提取、荧光素酶的添加、发光量的测定最后求出浓度并算出大肠菌群数量，除此之外，在测定样品时应使用表面活性剂对样品进行ATP萃取，因为ATP被细胞膜和细胞壁包围，表面活性剂能够使ATP释放出来。曹丽蓉等[34]使用该方法对282份食品进行检测，生物发光法的阳性率和大肠菌群的阳性率无显著差异（P> 0.05）。王东黎等[35]采用此法测定能量物质，无论是细菌还是食物样品，ATP含量均与其发光值存在极高的线性关系（R>0.99）。M.Niksic等[36]将该法与传统的微生物方法进行比较，结果证明二者具有高度相关性。ATP生物发光法检测大肠菌群具有快速、测定范围广、携带方便、能够进行即时检测作等优点。但该法也存在较多缺点，比如游离ATP和体细胞的干扰性较强、检出限较低、易受盐等成分干扰等缺点。

2.6.3培养基显色法

丁筠等[37]建立了一种快速检测大肠菌群数的方法，试验以乳糖胆盐培养基为基础培养基，向其中加入微凉的伊红美兰溶液作为颜色变化的指示剂，通过分光光度计，最终得到大肠菌群数量与吸光度值的标准曲线，该法精密度RSD小于2.75%，大大缩短了检测时间并使准备操作简单易行。

3 结语

传统的大肠菌群检测方法往往具有实验量大，步骤复杂，费时费力，检出限地、灵敏度差以及成本高等缺点，而近年来发展大肠菌群的快速检测方法主要有酶联免疫法、免疫胶体金法、PCR 法、快速测试片及试剂盒法等，从上述的分析可以看出，这些方法虽然解决了时间问题，但在检测敏感性、特异性、重复性以及操作上存在这样或那样的问题，没有一种方法能够真正达到成本低、灵敏度好、准确性高并且检测速度快的要求。并且这些方法的成本都比较昂贵，不适用于基层实验室的使用。因此要真正实现大肠菌群的快速检测还需要不断进行科学研究，以寻找更合适的方法。

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