血液miRNA检测在结直肠癌诊断、预后及化疗疗效评估中的应用进展

冯君兰，汪昱

(上海交通大学附属第六人民医院，上海200233)

结直肠癌(CRC)是临床常见的消化道恶性肿瘤之一，在西方发达国家其发病率居于恶性肿瘤的第2位，在我国其发病率和病死率均呈逐年上升的趋势［1］。提高CRC的生存率，其根本和关键在于早期诊断、预后判断及治疗监测［2］。目前，CRC的检测方法主要依靠内镜活检形态学病理检查和胃肠造影的影像学检查;而肿瘤患者出现影像学改变时大多已处于中晚期，且影像学对肿瘤病灶检出率较低;病理学检查为创伤性检查，必需经腔内取材后才能获得，而且临床常见有症状才来就诊。生化检查只需取患者少量体液或标本，且具有无创、简便及经济等优点，患者依从性好，易于实施，是大规模人群筛查的理想手段，但目前尚无理想的指标可供参考。微小RNA(miRNA)是继基因计划后近几年形成的生命科学的研究热点，其不仅仅存在于肿瘤组织中，还稳定存在于血液中，通过参与多种信号通路调控CRC的发生、发展［3］。现将血液中miRNA检测在CRC早期诊断、预后监测、化疗疗效评估中的应用进展综述如下。

1 miRNA的生物合成及作用机制

miRNA常簇生于蛋白编码基因的内含子中，其在体内的形成源于RNA聚合酶的转录产生1 000 bp左右的初级产物(pri-miRNA)，后者进一步在细胞核内被RNaseⅢ内切酶家族的Drosha酶剪切成70 bp左右的发夹式前体pre-miRNA，在Ran-GTP依赖的Exportin-5蛋白的作用下从核内运输到胞质中，后在Dicer酶的作用下，miRNA前体被剪切成21～25个核苷酸长度的单链miRNA，并结合到RNA诱导的基因沉默复合物(RISC)中，形成非对称RISC复合物，与靶mRNA3'端非翻译区(3'UTR)完全或不完全匹配结合，诱导靶mRNA降解或阻遏其翻译，从而在转录后水平沉默基因的表达，并通过细胞内复杂的调控网络对细胞代谢、分化、增殖与凋亡等进行调控［4］。因此，成熟miRNA的最终效应是通过阻止靶点蛋白的生成而下调其靶基因表达，一旦miRNA的表达水平失调，可导致包括肿瘤在内的多种疾病发生［5，6］。

2 血液miRNA检测在CRC早期诊断中的应用

最近研究显示，miRNA受内源性核糖核酸酶的保护，可以非常稳定地存在于人类血液中，尤其是恶性肿瘤患者的血清中，其表达水平足以供临床检测应用，从而为miRNA在肿瘤患者早期诊断中的应用提供了可行性［7］。Toiyama 等［8］发现，血清 miR-21表达水平可明确鉴别腺瘤及CRC，其AUC曲线下面积分别为 0.813(95%CI=0.691 ～0.910)和 0.919(95%CI=0.867 ～0.958);并且血清中 miR-21 的高表达与肿瘤体积、远处转移密切相关，并且患者的预后较差。Huang等［9］对120例CRC、37例晚期腺瘤患者及57例健康志愿者血清中12个miRNA(miR-134、miR-146a、miR-17-3p、miR-181d、miR-191、miR-221、miR-222、miR-223、miR-25、miR-29a、miR-320a、miR-92a)表达水平进行了检测，结果显示血清miR-29a、miR-92a可作为血清生物标志物联合应用于CRC患者的早期诊断。并且Wang等［10］也发现，血清miR-29a表达升高与较晚的肿瘤分期相关，鉴别转移与非转移CRC患者的敏感度和特异度均达到75%，较血清癌胚抗原更为敏感(敏感度和特异度分别为60%、34%)。此外，Ng等［11］利用 CRC 患者和健康对照组筛选发现了5个差异表达的miRNA(miR-135b、miR-95、miR-17-3p、miR-92、miR-222)在血清和组织中均出现高表达，进一步在25例CRC患者和20例健康对照者血清验证，结果发现CRC患者中miR-17-3p和miR-92表达显著增加，而在10例CRC术后患者血清中的表达显著降低;同时，miR-92的不同表达水平可用于鉴别CRC患者与胃癌患者、炎症性肠病患者和正常受试者，miR-92的AUC曲线下面积为88.5%，在临界值为240时，miR-92用于区分CRC和对照组的敏感性、特异性分别为89%、70%。目前，更多的血清miRNA相关的筛选研究已在CRC血清中鉴定出超过100种miRNA分子，其可作为CRC早期诊断的候选生物标志物。这些研究表明，血液中异常表达的miRNA有望在今后的临床检测中作为一种非侵入性的生物标志物应用于CRC的早期筛查和早期诊断。然而，肿瘤特异性miRNA的重叠性和差异性表达表明单个miRNA诊断CRC的敏感性和特异性较低，若能针对年龄相匹配的正常人、有早期病变的患者及不同阶段CRC患者建立一组外周循环血中miRNA的差异表达谱，即有望实现对早期病变和不同阶段CRC患者的早期诊断与精确评估。

3 血液miRNA检测在CRC预后判断中的应用

目前，多项研究已经证实了临床上检测CRC患者血液中miRNA表达谱的变化可用于对CRC患者的预后监测。血清miR-21目前被认为是适用于不同种族、不同地域CRC患者强有力的预后生物标志物［12～14］;研究［15］表明，血清高表达的 miR-21 可应用于Ⅱ期CRC患者的预后评估，即可在CRC早期阶段识别高风险患者的疾病进展。Toiyama等［16］首先利用12例CRC患者血清样本分析4个miR-200家族的 miRNA(miR-200b、miR-200c、miR-141、miR-429)，发现miR-200c与CRC的远处转移密切相关;后利用182例CRC患者及24例健康正常对照的血清进行验证分析 miR-200c表达水平，结果发现miR-200c在Ⅳ期CRC患者中的表达水平明显高于Ⅰ～Ⅲ期CRC患者，并且高表达的miR-200c与淋巴结转移、远处转移、预后密切相关(P均＜0.05);更为重要的是，血清miR-200c可作为独立的预后指标应用于CRC的淋巴结转移(HR=4.81;95%CI=1.98 ～ 11.7，P=0.0005)、肿瘤复发(HR=4.51;95%CI=1.56 ～13.01，P=0.005)及 CRC 患者预后(HR=2.67;95%CI=1.28 ～5.67，P=0.01)的监测。Cheng等［17］利用102例CRC患者的血浆标本检测miR-141的表达水平，结合CRC患者的临床病理特征进行分析，结果发现miR-141的表达水平与CRC的TNM分期密切相关，可作为转移性CRC的生物标志物;若联合临床常用的肿瘤标志物癌胚抗原，可提高对Ⅳ期CRC患者预后判断的敏感性和特异性;为了进一步提高证实此研究结果，再次利用156例CRC患者的血浆样本检测miR-141的表达水平，通过对2个队列的分析，证实了miR-141可作为晚期CRC患者的独立预后因素。Pu等［18］发现，CRC患者血清miR-221的高表达预示着CRC患者的生存期较短，预后较差;并且血清miR-221水平与p53基因的表达存在显著相关性，Kaplan-Meier曲线分析证实了miR-221可作为CRC患者独立预后因素应用于临床检测。目前这些研究均表明，CRC患者血清中特征性miRNA的差异表达可作为CRC患者预后评估的潜在生物标志物应用于临床。

4 血液miRNA检测在CRC化疗疗效评估中的应用

对于CRC患者来说，只进行手术切除是远远不够的，为了有效地治疗和控制疾病，应接受相应辅助化疗，以达到治疗效果。因此，化疗是治疗CRC的主要方法之一，近年来有关miRNA与CRC化疗关系的研究已逐渐成为关注的热点。目前，更多的研究集中在从CRC组织中研究差异miRNA在化疗耐药中的关键分子机制，较少的研究关注血清中miRNA是否应用于判断CRC患者的化疗敏感性。Zhang等［19］利用 miRNA表达谱芯片筛选 253例CRC血清样本与正常对照中的差异表达miRNA，并通过RT-PCR进一步验证分析，结果发现了5个特征性的血清 miRNA(miR-20a、miR-130、miR-145、miR-216、miR-372)可联合应用于预测CRC患者对化疗的敏感性，在两组CRC临床血清样本中ROC曲线下面积分别为 0.841、0.918。另外，Chen 等［20］首先利用表达谱芯片筛选出了5个CRC血清中差异表达的 miRNA(miR-221、miR-222、miR-122、miR-19a、miR-144)，进一步在72例临床CRC患者血清样本中验证分析，结果发现血清miR-19a的表达水平可以鉴别对化疗耐药的CRC患者，其敏感性及特异性分别为66.7%、63.9%，AUC曲线下面积为0.679。从目前上述两个CRC患者血清miRNA判断化疗敏感性研究得出，CRC患者血清中特征性miRNA可作为潜在的生物标志物应用于临床CRC化疗疗效的判断，尤其是化疗敏感性的监测，但进一步的大规模临床研究还有待于在以后的研究中开展。

目前，关于miRNA作为CRC生物标志物的相关研究已成为了研究的焦点，也取得了一定的研究成果，CRC患者血液中特征性miRNA有可能作为CRC筛查、早期诊断、预测监测及化疗疗效判断的生物标志物。然而，由于目前大多数研究仍属于临床样本量较小的回顾性研究。因此，今后仍需要开展大规模、多中心的前瞻性临床研究进一步证实血清特征性miRNA能够作为CRC患者早期诊断、预后判断及化疗疗效监测的生物标志物，从而为CRC患者的临床诊治提供新的策略和思路。

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