Wistar大鼠放射性腮腺损伤模型的建立

李海涛，李涛，董刚，卢恕来，郑建金

(青岛市市立医院，山东青岛266000)

随着放射治疗学的进展，射线对正常组织的损伤给患者带来一系列并发症，如腺体、颌骨损伤，特别是唾液腺中腮腺唾液分泌减少、口腔干燥、吞咽困难等，增加患者的痛苦［1］。因此，预防和治疗放射性腮腺损害已引起临床医师的重视。为了进一步研究放射性腮腺损害的病因和诊疗方法，本研究将用Wistar大鼠以β射线外照射制成腮腺放射损伤模型，为今后进一步研究放射性腮腺损伤及其药物筛选提供一定理论基础。

1 材料与方法

1.1 主要仪器及药物 石蜡切片机;恒温烤箱;超净工作台;光学显微镜;放疗直线加速器;显微成像系统。戊巴比妥钠。

1.2 实验动物及分组 SPF级健康雄性Wistar大鼠25只，10～12周，体质量280～300 g。由山东鲁抗医药股份有限公司提供。随机分为实验组(15只)和对照组(10只)。

1.3 放射性腮腺损伤模型制备 实验组大鼠采用40 mg/kg戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，后将大鼠以侧卧位束缚于实验动物固定板上实施照射，事先在右腮腺表面中心做染色标记，以减小多次放射视野标偏差。放射总剂量为40 Gy，放射源使用直线加速器(VARIAN，23EX，美国)6 MeV电子线，源皮距SSD 100 cm，剂量率DR 500 Mu/min。放射总剂量40 Gy，单次剂量500 cGy，2次/周。凝胶组织补偿垫厚0.5 cm，以滤过低能射线，减轻皮肤等浅表组织的过度损伤，同时提高实验动物接受射线能量的均衡度;1.2 cm铅板设4孔，防护周围正常组织，每孔照射视野1.6 cm×2.8 cm。照射孔经剂量每孔中心点剂量差控制在－5% ～5%，相同照射深度条件下，照射对称性－3% ～3%。对照组不进行照射处理，同标准饲养。

1.4 大鼠一般情况观察 放疗开始后观察大鼠饮食、体质量的变化及放疗区皮肤、毛发的变化;每次麻醉后观察口腔黏膜，尤其是右侧颊部黏膜的变化，注意有无放射性口腔黏膜炎等情况。标本切取时观察右侧腮腺腺体形态、颜色、质地、有无粘连等。

1.5 大鼠腮腺大体标本观察 放射结束后第28天，大鼠麻醉后，用剪刀沿右侧耳后直线剪开，于耳后咬肌上端表面见右侧腮腺，观察腺体形态颜色、质地、有无粘连等，之后将腮腺完整取下，置于中性甲醛溶液固定，石蜡包埋制备，切片后以HE染色。

1.6 大鼠腮腺组织病理学观察 光学显微镜下观察两组大鼠腮腺组织内腺小叶结构、腺泡结构、小叶间导管结构及腮腺组织内血管结构等变化。

1.7 大鼠腮腺毛细血管密度定量分析 将腮腺组织片置于倒置显微镜及显微成像系统，组织片在200倍视野下，随机选取10个视野进行毛细血管计数。

1.8 大鼠唾液量观察 大鼠经放疗后收集15 min内右侧腮腺唾液分泌量的差异(采用微型Lash ley吸盘法［2］)。Wistar大鼠麻醉后仰卧位固定于自制手术台上，大鼠吸气时迅速将塑料导管插入气管。用一小棉球擦干右侧的颊黏膜，将微型Lash ley吸盘置于右侧颊黏膜腮腺导管开口处。颈部皮下注射0.2%毛果芸香碱(2 mg/kg)，大约3 min左右，唾液开始分泌，弃掉开始几滴唾液，将唾液收集在已称重的Eppendorf管内。在收集唾液的过程中应保持鼠的头部合适位置避免发生窒息。

1.9 统计学方法 采用SPSS10.0统计软件。计量资料以±s表示，两组间比较采用t检验。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组大鼠一般情况比较 实验组:实验过程中腮腺照射区，无红肿、破溃等浅表组织灼伤的表现，口腔内颊部黏膜未出现充血、红斑、溃疡，亦无开口困难、进食明显减少等口腔功能明显受损表现。仅在后期即累积剂量达到30 Gy后有轻度局部脱毛现象。至40 Gy直线加速器照射后28 d，未出现皮肤黏膜破损，亦未出现实验中动物死亡、提尾旋转，狂躁等中枢性反应。照射开始第1周后，摄食、饮水量无明显变化;开始第2周起，开始出现每日摄食、饮水量减少，但未出现完全拒食、拒饮。体质量在整个照射过程中呈缓慢下降的趋势，开始第4周，体质量下降到最低点，随后呈缓慢回升的趋势。对照组:毛发、皮肤、口腔黏膜完整，饮食活动无异常，体质量变化不大。

2.2 两组大鼠腮腺大体标本比较 实验组的右侧腮腺呈灰白略带红色，质软，与周围组织无粘连，肉眼观和对照组大鼠右侧腮腺形态、大小、质地等无明显差异。

2.3 两组大鼠腮腺组织病理学比较 对照组:腺体组织结构清晰，腺叶间有薄层纤维结缔组织间隔，小叶间间隙较为均匀，小叶间导管和血管结构层次清晰;腺泡细胞排列紧密、有规则，胞质丰富，浅染，核大、无皱缩。毛细胞血管内皮不增生，内皮细胞扁平，不向管腔内突出。实验组:放疗4周后腺体组织结构疏松，小叶间隙扩大，腺泡胞质浓缩，染色深，核缩小，深染，腺泡分泌腔皱缩变形;小叶间导管和血管扩张，增厚，毛细血管内皮增厚，血管肿胀，周围组织有血管内皮增生，细胞呈胖梭型，向血管腔内突出，间质纤维组织增多，呈明显纤维化，并可见片状炎细胞浸润，以浆细胞和淋巴细胞为主。

2.4 两组大鼠唾液分泌量比较 实验组及对照组腮腺唾液分泌量分别为(2.45 ±0.25)、(147.12 ±23.38)mL，两组比较，P ＜0.05。

2.5 两组毛细血管密度比较 分别是实验组及对照组毛细血管密度分别为(77.6 ±9.04)、(41.7 ±11.19)个/视野，两组比较，P ＜0.05。

3 讨论

动物模型的建立应遵循与人类疾病的相似性、重复性、可靠性、适用性、可控性、易行性等原则［3～6］。为了尽可能接近于临床，以便更好地模拟临床头颈部放射治疗时的损伤状况，为相关研究提供稳定的实验平台。我们考虑制备放射性腮腺损伤模型应满足以下要求:①放疗剂量大小适宜，放疗区域接受剂量稳定均衡;②目标解剖区域的选择具有特异性，便于重复操作;③适当的模拟分割，以便更好模拟临床上分割放疗的效果;④能够形成典型的放射损伤病理改变。

3.1 放射源参数与剂量控制 为了保证目标解剖区域的选择具有特异性，避免邻近重要组织器官损伤干扰实验效果，本实验中专门选用1.2 cm铅板作为防护屏障，并在铅板上制备4个照射孔，每孔照射视野1.6 cm×2.8 cm。经剂量检测:每孔中心点剂量差－5% ～5%，相同照射深度条件下，照射对称性－3%～3%。考虑放射源产生的射线能量不能完全达到能量均衡的要求，我们加用凝胶组织补偿垫厚0.5 cm，以滤过低能射线，减轻皮肤等浅表组织的过度损伤，同时提高实验动物接受射线能量的均衡度。整个实验过程中未出现放疗实验动物明显的饮食、自主活动等异常改变，也说明剂量的选取和控制合理。

3.2 分割治疗与麻醉的矛盾 目前，临床上头颈部肿瘤的放射治疗将总剂量进行分割多次治疗，因此为了模拟临床治疗过程，动物实验亦应进行分次照射，但是多次照射就意味着多次麻醉，研究［7～9］认为多次麻醉易造成实验动物死亡。本预实验中采用40 Gy分割为10次照射时出现部分动物在后期麻醉后未能苏醒，正式实验时方案调整为8次照射，并加强麻醉后的观察和护理(包括适宜稳定的室温、适当的体位以保持呼吸通畅、较低的饲养密度减少复苏过程中的挤压踩踏以及充足的水和饲料)，实验过程中未出现动物因麻醉而死亡。

3.3 观察时间的选择 以往放疗动物模型实验均采用放疗后较短时间内处死动物进行相关检测，所得结果主要说明放疗后早期的病理改变情况，对于能否形成稳定的中后期放射损伤改变缺乏足够的说服力。本研究观察窗选在放射处理达到目标剂量后4周，此时的病理改变与目的改变相符更能说明本实验模型与临床治疗过程的一致性。

3.4 照射剂量—效应关系 短时间内大剂量单侧唾液腺照射，分割剂量5 Gy，3次/周，20 Gy腮腺分泌下降，40 Gy腮腺功能基本丧失。本实验中采用40 Gy分割为8次照射，腮腺分泌量明显减低。

3.5 病理改变 本实验中放疗4周后腺体组织结构疏松，小叶间隙扩大;间质纤维组织增多，呈明显纤维化，并可见片状炎细胞浸润;说明放射线照射下大鼠腮腺间质出现了明显退行性改变。腺泡胞质浓缩，染色深，核缩小，深染;腺泡分泌腔皱缩变形;说明放疗损伤导致了腺泡细胞的受损，其代谢活力明显减弱。腮腺内血管扩张，毛细血管内皮增厚，血管肿胀;血管内皮增生，细胞呈胖梭型，向血管腔内突出;说明腮腺区放疗损伤造成了腮腺内血管的管腔变小，影响了组织有效灌注，减少了氧和营养的供给。毛细血管的数较正常组织明显少，意味着放射损伤影响了新生血管的形成，组织的代谢和修复能力减弱。通过以上病理改变可以说明实验组的腮腺已存在较为典型的放疗损伤表现［5，6，10～12］。上述证据表明，我们的实验通过模拟分割照射，选择合适的吸收剂量及照射野，较好地模拟放射性腮腺损伤过程，造成了典型的放射损伤，并且剂量准确、控制条件准确、可重复性强，可作为放射损伤与修复相关研究的模型，为研究放射性腮腺损伤的发病机理及治疗提供了基础。

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