鱼藤酮诱导制备SD大鼠帕金森病模型的可行性

柴星星，鲍波，叶成，利慧华，朱少平，曾敏娟

(广东医学院，广东湛江524000)

鱼藤酮诱导制备SD大鼠帕金森病模型的可行性

柴星星，鲍波，叶成，利慧华，朱少平，曾敏娟

(广东医学院，广东湛江524000)

目的 采用长期低剂量皮下注射鱼藤酮的方法制备SD大鼠帕金森病模型。方法 将36只SD大鼠随机分为实验组24只和对照组12只，实验组给予l.5 mg/(kg·d)鱼藤酮皮下注射，对照组注射等体积葵花油，连续30 d，每周停药1 d。给药结束后进行行为学测试，并断头取脑，采用免疫组化SP法检测中脑黑质多巴胺能神经元数目。结果 对照组行为学改变不明显，其黑质多巴胺能神经元数目较多；实验组出现明显的行为学改变，其黑质多巴胺能神经元数目减少，符合PD的诊断标准。结论 颈背部皮下注射鱼藤酮可成功制备SD大鼠帕金森病模型。

帕金森病；鱼藤酮；大鼠；TH阳性细胞

帕金森病(PD)是一种以中脑黑质致密部多巴胺能神经元退行性变为主要病理特征的慢性神经系统疾病。2012年8月，我们对SD大鼠长期低剂量皮下注射鱼藤酮，观察其行为学变化、脑黑质中酪氨酸羟化酶(TH)阳性细胞病理变化及细胞数量的改变，据此建立鱼藤酮诱导的SD大鼠帕金森病模型，为临床预防和治疗PD奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料 SPF级健康成年雄性SD大鼠36只，体质量180～200 g，由广东医学院实验动物中心提供。使用标准饲料饲养于温度20～22 ℃、湿度45%～65%、光照12 h明暗交替环境中，自由摄食、摄水。鱼藤酮(美国Sigma)，TH小鼠单克隆抗体(CST)，超敏型ABC免疫组化染色试剂盒(福州迈新)，DAB试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 模型制作 大鼠适应性饲养l周后，随机分为实验组24只和对照组12只，参考文献[1，2]方法建立PD模型。实验组于颈背部皮下注射鱼藤酮葵花油乳化液1.5 mg/(kg·d)，鱼藤酮在葵花油中的浓度为1.5 mg/mL；对照组注射等体积葵花油。每天上午8:00注射，注射前测量动物体质量，每周停药1次，共30 d。由于鱼藤酮具有全身毒性作用，因此给药期内动物出现四肢不能站立行走、翻身困难、丧失主动进食能力时，立即终止注射，终止注射的大鼠在最后1次给药1 d后对实验组进行筛选时根据终止注射的时间选择纳入或排除出后续研究和统计分析。最后1次给药1 d后对实验组进行筛选，筛选模型制作成功的标准为：给药3周以后才开始出现四肢不能站立行走、翻身困难、丧失主动进食能力[3]；拒捕行为减弱、竖毛、毛色变黄变脏、弓背，主动活动减少明显、动作迟缓，并有震颤，或有步态不稳[4]。排除死亡和不符合上述要求的大鼠，实验组共12只进入下一步实验。

1.2.2 行为学测试 最后1次给药1 d后对两组分别进行行为学测试。

1.2.2.1 网格实验[5]用于检测大鼠全身僵直情况。将大鼠头朝上置于一个与水平面垂直的独立金属网格(长80 cm、宽50 cm、格间距1 cm)的中央，使其趾爪均抓住金属网格，并保证在此位置上大鼠无法抓住网格边缘或其他附带物，放置大鼠的同时用秒表记时，记录大鼠由静止状态至任意一爪移动所间隔的时间，即为移动潜伏期。每只大鼠重复测量3次，每次间隔5 min。

1.2.2.2 悬挂实验 用于检测大鼠肌张力。将大鼠两前爪悬挂于水平放置的金属丝(直径2 mm、长约30 cm)上，金属丝距地面1 m，记录大鼠落地前的时间，如大鼠在3 s内跌落或仅一个爪抓住金属丝均属失败。对悬挂时间进行评分，0～4 s为0分，5～9 s为1分，10～14 s为2分，15～19 s为3分，20～24 s为4分，25～29 s为5分，超过30 s为6分。每只大鼠重复测量3次，每次间隔5 min。

1.2.2.3 跨步实验[6]用于考察大鼠前肢运动功能。操作者一手固定大鼠躯体后半部和后肢使其离地，另一手固定一侧前肢使另一前肢着地，以大鼠正手方向斜向一侧移动，5 s内移动90 cm，记录大鼠移动时着地侧前肢跨步数，交替测量两侧上肢的跨步数，取两侧跨步数的总和为最终纪录结果。

1.2.3 脑标本的制作 行为学检测完毕后对大鼠腹腔注射10%水合氯醛进行麻醉，迅速断头取脑，于冰面上快速分离脑组织，冰生理盐水漂洗，除去脑膜和血液。每组随机取6只样本于冰皿上剥离黑质，4%多聚甲醛固定，脱水、透明、石蜡包埋，切片机连续做冠状切片，其余脑组织分离获取中脑后称取质量，-80 ℃保存待用。

1.2.4 TH阳性细胞检测 采用免疫组化SP法，取石蜡切片，经二甲苯及梯度乙醇脱蜡，加入3% H2O2，PBS浸洗，高压抗原修复，滴加封闭血清室温孵育10 min，依次加入一抗(CST，1∶300)、生物素标记的二抗、辣根酶标记的链霉卵蛋白工作液孵育，PBS洗涤，DAB显色，苏木素复染，脱水透明，中性树脂封片，光学显微镜下观察。先在100倍镜下选择TH阳性细胞(其细胞形态较完整，多为椭圆形和粒状，胞质内棕色颗粒浓密，部分可见神经突起及其分支)密集区，然后在400倍镜下计数TH阳性神经细胞个数，每个脑组织黑质部位包块选4张连续切片，计算平均值。

2 结果

2.1 一般症状观察 对照组毛色光亮，活泼好动，饮食如常，体质量正常增长。实验组给药1周后体质量明显下降，自主活动减少，抗捕捉反应减少，而症状最严重最突出的时间段多为3～4周。部分大鼠由于行动和摄食能力部分或完全性丧失，体质量下降较快；毛色发黄变脏，动作迟缓，弓背及抓握状姿势，四肢僵硬或瘫痪并伴有震颤等症状；少数大鼠出现口鼻黏膜及四肢末端皮下少量出血，间歇性抽搐和翻滚，甚至完全丧失行动能力，停止注射鱼藤酮后多数大鼠症状有所减轻，体质量回升，少数大鼠停药后症状持续加重，最终死亡。

2.2 鱼藤酮对大鼠行为学的影响

2.2.1 两组网格实验结果比较 鱼藤酮处理第30天时，实验组网格实验反应时间为(4.32±0.72)s，对照组均<1 s，两组比较有统计学差异(P<0.05)。

2.2.2 两组悬挂实验结果比较 鱼藤酮处理第30天时，观察组悬挂实验评分为(1.42±1.08)分，对照组为(4.08±2.27)分，两组比较有统计学差异(P<0.05)。

2.2.3 两组跨步实验结果比较 鱼藤酮处理第30天时，观察组肢体运动功能明显减退，跨步实验前肢跨步数为(17.50±3.58)步，对照组为(27.25±1.65)步。两组比较有统计学差异(P<0.05)。

2.3 两组黑质TH阳性神经细胞数比较 免疫组化结果显示，对照组黑质TH阳性神经细胞数为(115.75±15.06)个，实验组为(48.83±10.58)个，实验组TH阳性神经细胞数目显著下降(P<0.05)。对照组中黑质可见大量规则状TH阳性细胞和神经纤维，其细胞形态较完整，多为椭圆形和粒状，胞质内棕色颗粒浓密，部分可见神经突起及其分支，TH阳性细胞呈特异性条带型分布。实验组黑质TH阳性细胞神经元数目明显减少较多，且细胞染色变浅，着色不均，残存的TH阳性神经元呈现胞体肿胀、萎缩，神经突起减少或消失的现象，大部分形态已明显改变，呈三角形或不规则多边形，并且细胞的轮廓不清晰,显示神经元进行性退化特征，带型模糊。

3 讨论

建立合适的PD动物模型是开展PD研究的重要内容和工具[7]。目前已经建立的PD动物模型主要有利血平模型、6-OHDA模型、甲基苯丙胺模型、百枯草模型、代森锰模型、MPTP模型、鱼藤酮模型、脂多糖模型[8]以及基因敲除与转基因动物模型[9]等。由于PD多巴胺黑质神经元选择性丢失的确切机制尚不明确，其模型的建立也一直处于不断改进当中。

鱼藤酮是由醉鱼科植物毛鱼藤的胶状液汁提取的化学物质，具有很强的亲脂性，能轻易透过血脑屏障进入神经细胞胞质内，并选择性聚集在线粒体等细胞器，抑制线粒体呼吸链复合体I活性，损害氧化磷酸化，进而产生细胞毒性作用。2000年，Betarbet等[5]首次使用鱼藤酮成功诱导出PD大鼠模型。研究表明，鱼藤酮诱导的PD模型在重现PD疾病行为学变化的同时，其病理学特征同人类PD疾病具有高度的相似性。此外，鱼藤酮是一类广泛分布于自然界的环境毒素，这与PD流行病学调查结果相符。因此，鱼藤酮诱导的PD模型在发病机制上可能更接近人类PD的自然进程。但鱼藤酮诱导的PD动物模型存在死亡率高、成模率低、操作复杂、成本相对较高等缺点，已报道的PD动物模型研究也多采用小鼠进行。由于PD动物模型的研究涉及黑质纹状体部位的给药和取材，黑质纹状体体积较小，定位困难，相对小鼠而言，大鼠脑部尺寸较大，有利于脑部各区的立体定位，给药和取材的精确性较高。因此本实验选用生命力强、抗感染能力好的SD大鼠进行PD模型的制备。

采用鱼藤酮制备帕金森病动物模型的给药方法主要有口服法、皮下注射法、腹腔注射法、微泵静脉灌注射法和黑质立体定向注射法等[10]。考虑到鱼藤酮的全身毒性作用导致的死亡率较高，且小剂量鱼藤酮的作用更能体现慢性疾病的致病过程,本实验中在给药途径上采用吸收较缓慢的长期低剂量皮下注射鱼藤酮的方法。实验中观察到，皮下给药1周后，鱼藤酮给药组即出现明显的主动摄食减少，体质量逐渐减轻，部分大鼠由于行动和摄食能力部分或完全性丧失，体质量下降较快。同时可见大鼠毛色发黄变脏、动作迟缓、弓背及抓握状姿势、四肢僵硬或瘫痪、并伴有震颤等症状。与文献[1]报道相一致。此外，部分大鼠还出现口鼻黏膜及四肢末端皮下少量出血，或有间歇性抽搐和翻滚，甚至完全丧失行动能力，这可能与SD大鼠个体间的差异性有关。

行为学测试表明，经鱼藤酮处理第30天鱼藤酮处理组网格实验反应时间明显长于对照组，表明鱼藤酮处理组全身僵直症状严重；悬挂实验中，鱼藤酮处理组评分降低，提示肌张力增高；跨步实验结果也表明鱼藤酮处理组运动协调性下降明显。根据上述行为学表现及症状等可以初步判断PD模型复制成功，表明长期颈背部皮下注射鱼藤酮的方法复制PD模型是可行的。

本研究对多巴胺能神经元TH阳性细胞进行免疫组化检测，结果显示，对照组黑质区可见大量规则状TH阳性细胞和神经纤维，TH阳性细胞数目为(115.75±15.06)个，其细胞形态较完整，多为椭圆形和粒状，胞质内棕色颗粒浓密，部分可见神经突起及其分支，TH阳性细胞在黑质区呈特异性条带形分布；鱼藤酮处理组TH阳性细胞数目明显减少，染色变浅，着色不均，残存TH阳性神经元呈现胞体肿胀、神经突起减少或消失的现象。有研究表明，鱼藤酮诱导PD模型的机理可能同鱼藤酮具有极强的亲脂性有关，鱼藤酮在不依赖DA转运体的情况下自由通过血脑屏障和细胞膜并聚集在细胞器如线粒体内，可选择性抑制线粒体复合物Ⅰ的活性，产生活性氧和释放凋亡诱导因子，引起氧化应激和细胞凋亡[11]。两组无论是TH阳性细胞数量还是染色形态等都存在明显差异，提示鱼藤酮处理导致了相应的病理改变，且与鱼藤酮处理组显现的PD行为学改变相一致。

综上所述，综合病理症状、行为学改变、TH阳性细胞数对建立的PD模型进行评价，表明通过长期低剂量皮下注射鱼藤酮制作大鼠PD模型是成功的，可以较好地模拟PD的相关特征，在PD病理机制及药物对PD的预防、治疗研究中具有很好的应用前景。

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[2] 李云鹏,董兆君,王仕丽,等.重复注射鱼藤酮对中枢多巴胺神经元的毒性作用[J].第三军医大学学报,2003,25(13):1123-1126.

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[5] Betarbet R, Sherer TB, MacKenzie G, et al. Chronic systemic pesticide exposure reproduces features of Parkinson's disease[J]. Nat Neurosci, 2000,3(12):1301-1306.

[6] Chang JW, Wachtel SR, Young D, et al. Biochemical and anatomical characterization of forepaw adjusting steps in rat models of Parkinson's disease: studies on medial forebrain bundle and striatal lesions[J]. Neuroscience, 1999,88(2):617-628.

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Establishment of PD models in SD rats induced by rotenone

CHAIXing-xing，BAOBo，YECheng，LIHui-hua，ZHUShao-ping，ZENGMin-juan

(GuangdongMedicalCollege,Zhanjiang524000,China)

Objective To established PD models by long term subcutaneous injection of rotenone. Methods Totally 36 SD rats were randomly divided into two groups: control group contained 12 rats and model building group contained 24 rats. Rats in model building group were treated with rotenone at dose of 1.5 mg/(kg·d) by subcutaneous injection for 30 days, withdrawal one day a week. Rats in control group were treated with the same volume of sunflower oil. After the end of subcutaneous injection, the behavior changes of SD rats were tested and then sacrificing the rats to take out the brain tissues, detecting the expression of TH-positive cells in substantia nigra by counting out the number of TH-positive cells. Results The behavior changes of SD rats in control group were not obvious, but the number of dopaminergic neurons increased. The behavior changes of SD rats in model building group was obvious, and their dopaminergic neurons numbers decreased. SD rats in model building group met the diagnostic criteria of PD. Conclusions The methods of long-term subcutaneous injection of rotenone could establish PD models in SD rats.

Parkinson disease; rotenone; rats; TH-positive cells

广东省科技计划项目(2010B060500015)；广东省科技计划项目(2013B060300038)。

柴星星(1985-)，男，硕士，研究方向为神经系统疾病的病理和生理机制，E-mail: chaixingxingyu@163.com

鲍波(1968-)，男，副教授，硕士生导师，研究方向为神经系统疾病的病理和生理机制。主持广东省自然科学基金项目2项，湛江市科技攻关课题1 项及广东医学院院级课题2项，作为主要参与人参与2项国家自然科学基金、3项省部级科学基金研究。E-mail:you_and_me_2008@yeah.net

10.3969/j.issn.1002-266X.2015.01.003

R742.5

A

1002-266X(2015)01-0009-04

2014-09-18)