肾积水患者血清、肾组织Ⅲ型胶原表达与肾纤维化程度关系的探讨

张亮，刘玉强，李远，张磊，邵光峰，马敏(山东大学第二医院，济南500;山东大学第二医院; 山东大学齐鲁医院;浙江省金华市中心医院)

肾积水患者血清、肾组织Ⅲ型胶原表达与肾纤维化程度关系的探讨

张亮1，刘玉强2，李远3，张磊2，邵光峰2，马敏4
(1山东大学第二医院，济南250033;2山东大学第二医院; 3山东大学齐鲁医院;4浙江省金华市中心医院)

摘要:目的观察肾积水患者血清、肾组织Ⅲ型胶原表达变化，探讨其与肾纤维化程度的关系。方法选择轻、中、重度肾积水患者各10例，分别为轻、中、重度肾积水组;选择10例无肾积水的肾癌或肾外伤患者为对照组。采用放射免疫法检测各组血清Ⅲ型前胶原(PCⅢ)、Ⅲ型前胶原氨基末端肽(PⅢNP)。手术时取各组患者肾组织(对照组取正常肾组织)用免疫组化SP法检测肾组织Ⅲ型胶原表达，以IOD值表示。HE染色后光镜下观察，计算病变肾小管肾间质(包括肾小管萎缩、肾间质炎症细胞浸润、肾间质纤维化、血管硬化)占肾小管和肾间质的体积比率(简称病变肾小管肾间质比率)。结果四组患者血清PCⅢ、PⅢNP水平及肾组织Ⅲ型胶原IOD值、病变肾小管肾间质比率均为重度肾积水组高于中度肾积水组、中度肾积水组高于轻度肾积水组、轻度肾积水组高于对照组，P均＜0.05。轻、中、重度肾积水患者血清PCⅢ、PⅢNP水平及肾组织Ⅲ型胶原表达变化与病变肾小管肾间质比率呈正相关(r=0.749、0.763、0.896，P均＜0.05)。结论肾积水患者血清、肾组织Ⅲ型胶原表达随肾积水严重程度加重而增多，Ⅲ型胶原表达异常参与了肾积水所致肾组织纤维化的形成。血清PCⅢ、PⅢNP水平与肾积水所致肾间质病变纤维化程度相关。

关键词:肾积水;肾纤维化;Ⅲ型胶原;亚型胶原

肾积水是泌尿外科常见病症，又称梗阻性肾病，最终导致肾实质纤维化、肾脏萎缩［1］。肾活检是判断肾组织纤维化的金指标，但其操作复杂且有一定的风险性，因此寻找相关的实验室指标具有重要意义。2009年1月～2009年12月，我们检测了肾积水患者血清Ⅲ型前胶原(PCⅢ)、Ⅲ型前胶原氨基末端肽(PⅢNP)水平变化及肾组织Ⅲ型胶原表达水平，并分析其与梗阻性肾病患者肾纤维化程度的相关性。现报告如下。

1　资料与方法

1.1临床资料选择轻度肾积水患者10例为轻度肾积水组，其中男6例、女4例，年龄19～48岁。中度肾积水患者10例为中度肾积水组，其中男5例、女5例，年龄21～44岁。重度肾积水患者10例为重度肾积水组，其中男4例、女6例，年龄21～73岁。均根据B超检查结果确诊。无肾积水患者10例为对照组，其中肾透明细胞癌患者8例、肾外伤2例，男7例、女3例，年龄26～65岁。各组患者入院查体肝炎病毒血清标志物均无异常，肝功能均正常。所有患者肝、胆、胰、脾B超无明显异常，胸片心、肺无明显异常。既往无其他脏器的良、恶性肿瘤史。近期无外伤或手术史。无肾外脏器纤维化。各组年龄、性别差异无统计学意义。

1.2血清PCⅢ及PⅢNP检测四组患者均于入院查体时由肘静脉处抽取外周静脉血3 mL，室温下静置8 h，4℃、2 500 r/min离心15 min，离心半径5 cm。留上层血清置－20℃冰箱保存待测。采用放射免疫法检测血清PCⅢ及PⅢNP。PCⅢ放射免疫试剂盒购自上海海军医学研究所生物技术中心。P ⅢNP放射免疫试剂盒购自北京北方生物技术研究所。操作按试剂盒说明书进行。正常参考值血清PCⅢ＜120 ng/mL，PⅢNP＜120 μg/mL。

1.3肾组织Ⅲ型胶原表达检测轻度、中度积水组肾组织标本系肾切开取石术、经皮肾镜碎石术、输尿管肿瘤根治术或肾盂输尿管成形术中取得，重度肾积水组肾组织标本系经肾切除术中留取的残存肾皮质;对照组肾癌患者肾组织标本系肾癌根治术中需留取癌旁5 cm以外的正常肾组织，肾外伤患者肾组织系行肾切除术时留取的正常肾组织。所有肾组织标本用甲醛固定做成蜡块待用。取上述蜡块常规切片并行免疫组化SP染色，操作按试剂盒说明书进行。每张切片在肾小管或肾间质随机选取10个高倍镜视野(×400)，用OlympusBX500图像分析仪、HPIAS21000高清晰度彩色病理图文报告分析系统进行分析，测定积分光密度(IOD)值。

1.4肾组织纤维化程度检测取上述肾组织蜡块，常规切片并行HE染色，采用10×10网格多能目镜测试系统进行形态测量，按文献采用点计数法［3］，计算病变肾小管肾间质(包括肾小管萎缩、肾间质炎症细胞浸润、肾间质纤维化、血管硬化)占肾小管和肾间质的体积比率(以下简称病变肾小管肾间质比率)。

1.5统计学方法采用SPSS16.0统计软件。四组血清PCⅢ、PⅢNP水平及Ⅲ型胶原积分光密度值比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)，血清PCⅢ、PⅢNP水平及Ⅲ型胶原积分光密度值组间两两比较采用LSD t检验;病变肾小管肾间质比率比较采用率的χ2检验;血清PCⅢ、PⅢNP水平及肾组织Ⅲ型胶原表达变化与病变肾小管肾间质比率的关系采用直线回归法行相关性分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1血清PCⅢ、PⅢNP水平及肾组织Ⅲ型胶原表达四组血清PCⅢ、PⅢNP水平及肾组织Ⅲ型胶原表达见表1。由表1可见，四组患者清PCⅢ、PⅢNP水平及肾组织Ⅲ型胶原IOD值重度肾积水组高于中度肾积水组、中度肾积水组高于轻度肾积水组、轻度肾积水组高于对照组，P均＜0.05。

表1　四组患者血清PCⅢ、PⅢNP水平及肾组织Ⅲ型胶原表达比较(±s)

注:与对照组相比，*P＜0.05;与轻度肾积水组相比，#P＜0.05;与中度肾积水组相比，ΔP＜0.05

?

2.2肾组织纤维化程度对照组肾实质组织HE染色可见肾小管管腔无扩张，肾间质无增宽，间质内纤维细胞少而且排列有序。轻、中、重度肾积水组肾实质组织HE染色可见肾组织水肿，肾间质充填着排列无序的明显增多的纤维细胞，并有炎细胞浸润，肾小管管腔扩张明显。轻度积水组、中度积水组、重度肾积水组和对照组病变肾小管肾间质比率分别为10.80%±3.74%、25.12%±8.60%、40.20%± 13.50%、2.00%±0.53%。肾组织病变肾小管肾间质比率重度肾积水组高于中度肾积水组、中度肾积水组高于轻度肾积水组、轻度肾积水组高于对照组，P均＜0.05。

2.3血清PCⅢ、PⅢNP水平及肾组织Ⅲ型胶原表达与肾组织纤维化程度的相关性轻、中、重度肾积水患者血清PCⅢ、PⅢNP水平、肾组织Ⅲ型胶原表达变化与病变肾小管肾间质比率呈正相关(r=0.749、0.763、0.896，P均＜0.05)

3　讨论

肾组织纤维化的本质是肾脏微环境改变导致各种正常及异常细胞外基质(ECM)在肾小球及肾间质过度堆积，导致肾组织正常结构破坏、有效肾单位毁损和肾功能进行性下降［4～6］。在间质沉积的ECM的主要成分是Ⅰ型和Ⅲ型胶原、纤维连接蛋白及层粘连蛋白［7］。Atul等［8］研究兔单侧输尿管结扎所致肾小管肾间质纤维化模型，发现梗阻后第7天和第16天，肾间质Ⅰ型和Ⅲ型胶原明显增加。其他研究也表明多种肾脏疾病所致肾纤维化患者肾组织Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型胶原mRNA的表达增加［9］。降解Ⅲ型胶原的主要蛋白基质金属蛋白酶的减少也是肾纤维化的一个重要原因［10］。已有研究证实血清P ⅢNP水平与Ⅲ型胶原纤维的合成总量成正比［11］。同时Ⅲ型胶原合成时PCⅢ也可经毛细血管进入血循环，因此血清PCⅢ、PⅢNP水平可以作为反映肾组织Ⅲ型胶原表达水平的间接指标。本研究轻、中、重度肾积水组患者血清PCⅢ及PⅢNP水平均明显高于对照组，且随积水程度加重血清PCⅢ、PⅢNP水平呈递增趋势;血清PCⅢ及PⅢNP水平与病变肾小管肾间质比率呈显著正相关，说明检测血清PCⅢ、PⅢNP水平可简便、直观的反映肾积水所致肾纤维化过程中病变肾小管肾间质的比率，间接反映肾间质纤维化程度。

肾脏纤维化过程中，产生基质的细胞活化是纤维化的关键。生理情况下，成纤维细胞产生适量的胶原基质充填肾单位、血管和肾被膜之间的空隙;而损伤及炎症因素持续存在时，成纤维细胞会增殖并产生过量的细胞外基质(主要是Ⅲ型胶原)沉积于肾间质。成纤维细胞的增多主要有两方面的原因:①肾纤维化早期，肾小球系膜细胞和纤维母细胞发生活化并向成纤维细胞转变;②中晚期大量的肾小管上皮细胞向间充质细胞转分化，主要转化为成纤维细胞［12，13］。在肾纤维化模型中成纤维细胞可占到50%［14］，同时，当损伤因素持续存在时，各种细胞因子如表皮生长因子、转化生长因子β作用于肾小管上皮细胞，使EMT现象更加明显［14］。最终，成纤维细胞数量明显增多并分泌大量的细胞外基质(主要是Ⅲ型胶原)沉积于肾间质，导致肾纤维化程度逐渐加重。本研究结果显示，肾积水患者肾组织Ⅲ胶原的表达量与肾组织纤维化程度呈正相关。Ⅲ胶原主要分布在肾间质、肾小管基膜，说明肾积水肾间质纤维化，ECM过度沉积，Ⅲ型胶原是其中最重要的成分之一，主要分布在肾间质，肾小管基膜。同时也表明Ⅲ型胶原表达异常参与了肾积水所致肾组织纤维化的形成。Ⅲ型胶原合成增多、沉积以及降解的减少在肾积水导致肾纤维化过程中发挥着重要的作用。

综上所述，尿路梗阻导致肾积水后，肾脏Ⅲ型胶原生成增加;随着肾积水程度加重，Ⅲ型胶原增多越明显;Ⅲ型胶原浓度改变与积水肾脏间质病变、肾纤维化密切相关，在排除肾外脏器纤维化的前提下，血清PCⅢ、PⅢNP水平在早期预测积水肾纤维化程度方面有一定价值。本研究的缺点是标本量较少，故本研究结果还需进一步研究证实。

参考文献:

［1］McClellar WM.Epidemiology and risk factors for chronic kidney disease［J］.Med Clin North Am，2005，89: 419-445.

［2］Rerolle JP，HertigA，Nguyen G，et al.Plasminogen activator inhibitor-1 is a potential in renal fibrogenesis［J］.Kidney Int，2000，58 (9) : 1841-1850.

［3］申洪，沈忠英.实用生物体视学技术［M］.广州:中山大学出版社，1991: 26-80.

［4］McClellar WM.Epidemiology and risk factors for chronic kidney diease［J］.Med clin North Am，2005，89: 419-445.

［5］Zeisberg M，Maeshima Y，Mosterman B，et al.Renal fibrosis: Extracellular matrix microenvironment regulates migratory behavior of activated tubular epithelial cells［J］.Am J Pathol，2002，160 (6) : 2001.

［6］Schieppati A，Remuzzi G.Chronic renal diseases as a public health problem: epidemiology，social，and economic impliea-tions ［J］.Kidney Int Suppl，2005，98: 7-10.

［7］Samuel CS，Mookerjee I，Masterson R，et al.Relaxin regulates collagen overproduction associated with experimental progressive renal fibrosis［J］.Ann NY Acad Sci，2005，1041: 182-184.

［8］Sharma AK，Mauer SM，Kim Y，et al.Interstitial fibrosis in obstructive nephropathy［J］.Kidney Int，1993，44: 774-778.

［9］Wu K，Setty S，Mauer SM，et al.Altered kidney matrix gene expression in early stages of experimental diabetes［J］.Acta Anat Basel，1997，158: 155-165.

［10］Ahmed AK，Haylor JL，El Nahas AM，et al.Localization of matrix metalloproteinases and their inhibitors in experimental progress Ⅳe kidney scarring［J］.Kidney Int，2007，71(8) : 755-763.

［11］Iwano M，Neilson EG.Mechanisms of tubulointerstitial fibrosis.Curr Op in Nephrol Hypertens，2004，13: 279-284.

［12］Liu Y.Ep ithelial to mesenchymal transition in renal fibrogenesis: pathologic significance，molecularmechanism，and therapeutic inter2vention.J Am Soc Nephrol，2004，15: 1-12.

［13］Eric G Neilson.Mechanisms of Disease: fibroblasts-a new look at an old problem.Nature Clin Prac Nephrol，2006，2(2) : 101-108.

［14］Iwano M，Plieth D，Danoff TM，et al.Evidence that fibroblasts derive from epithelium during tissue fibrosis.J Clin Invest，2002，110: 341-350.

［15］LIU Y.Renal fibrosis: new insights into the pathogenesis and therapeutics［J］.Kidney Int，2006，69: 213-217.

(收稿日期:2015-04-25)

文章编号:1002-266X(2015) 22-0090-03

文献标志码:B

中图分类号:R692.2

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.22.037