血清水通道蛋白4抗体测定在视神经脊髓炎疾病谱中的意义

李婷，张大启，杨春生，翟翬

(天津医科大学总医院，天津 300052)

视神经脊髓炎(NMO)是视神经和脊髓同时或相继受累的中枢神经系统脱髓鞘疾病。自2004年Lennon等［1］利用间接荧光免疫法(IIF)在NMO患者血清中发现了水通道蛋白4(AQP4)抗体以来，诸多研究表明，NMO是一类有别于多发性硬化(MS)的中枢神经系统脱髓鞘性疾病单元，并称之为视神经脊髓炎疾病谱(NMOSD)［2］。目前在 NMOSD临床诊断和研究中血清AQP4抗体检测多为定性测定，而定量检测较少。本研究利用荧光免疫沉淀(FIPA)法检测75例中枢神经系统脱髓鞘疾病患者血清 AQP4 抗体［3～5］，并分析血清 AQP4 抗体水平与NMOSD临床特征的关系。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择2011年7月～2014年8月天津医科大学总医院神经内科就诊的75例中枢神经系统脱髓鞘疾病患者。患者的人口统计学及临床相关信息均被收集并录入中枢神经系统脱髓鞘疾病数据库。NMOSD患者55例［男9例、女46例，年龄(43.1 ±1.9)岁，病程(3.6 ±0.8)年，脊髓受累节段数(5.6±0.5)个，首次发病扩展残疾状况评分量表(EDSS)评分(4.8 ±0.8)分，2 年内复发(1.7 ±0.1)次］，其中NMO患者13例、复发性长节段横贯性脊髓炎(LETM)患者30例、复发性视神经炎(ON)患者12例，均符合2006年Wingerchuk等［2］修订的NMO及其疾病谱诊断标准;MS患者20例［男6例、女14例，年龄(33.9 ±3.9)岁，病程(4.0±0.9)年，脊髓受累节段数(1.9 ±0.1)个，首次发病 EDSS评分(1.8±0.7)分，2年内复发(1.4±0.4)次］，均符合 2005 年MS 诊断标准［6］。以上疾病均由3名有丰富神经免疫疾病临床经验的医师共同诊断，EDSS由已获得EDSS评分国际资格认证的医师评价。此外，尚有阳性对照组(PC)2例，血清由英国牛津大学临床神经科实验室提供;疾病对照组(OND)10例，重症肌无力和吉兰巴雷综合征各5例;健康对照组(HC)10例，来源于我院健康体检中心。

1.2 血清AQP4抗体测定 采集静脉血，分离血清冻存于 -80 ℃。参照文献［3～5］方法，采用 FIPA 法检测血清AQP4抗体。EGFP标记的人AQP4 cDNA质粒和EGFP cDNA质粒由英国牛津大学临床神经科惠赠。解冻待测组血清，4℃、10000 r/min离心5 min，取上清 5 μL 和 10 μL，分别加入 50 μL EGFPAQP4抗原提取液，混合后4℃轮转过夜，然后加入适量非特异山羊抗人 IgG，4℃孵育2 h，10000 r/min离心3 min，弃上清，收集沉淀，最后用1 mL裂解提取缓冲液漂洗沉淀，重复3次;将沉淀移入96孔板中，在高速多通道连续波长酶标仪上获取荧光吸光度，以健康对照组荧光均值+3倍标准差以上为阳性判断标准，每份血清检测均双盲，并重复3次。

1.3 统计学方法 采用GraphPad Prism5.0对数据进行绘图及统计分析，相关性数据采用Spearman相关分析。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

NMOSD患者中FIPA阳性42例，NMO患者中FIPA阳性11例，LETM患者中FIPA阳性23例，ON患者中FIPA阳性8例，MS患者中FIPA阳性0例。在NMO和LETM抗体阳性患者中，AQP4抗体FU值与脊髓受累长度呈正相关(rs=0.188，P=0.012)。在血清 AQP4抗体阳性的 NMOSD患者中，AQP4抗体FU值与首次发病2年内复发次数均无相关性。4例血清AQP4抗体阳性的NMOSD患者经甲强龙冲击、强的松和(或)硫唑嘌呤等免疫抑制剂治疗后，半个月至5个月患者血清AQP4抗体逐渐转为阴性。

3 讨论

NMO是一类以体液免疫为主的中枢神经系统脱髓鞘性疾病，临床症状重，病程长，致残率高，对免疫抑制剂治疗效果较好。研究［7］认为，NMO是以AQP4为靶抗原的自身免疫性疾病，对此类患者早期进行血清AQP4抗体检测，有助于该病的早期诊断治疗、复发预防及预后改善。目前国外多家神经免疫中心已建立起多种可用于检测血清AQP4抗体敏感性、特异性均较高的临床检测方法。自2004年Lennon等［1］利用 IIF法在 NMO患者血清中发现AQP4抗体以来，用于检测血清AQP4抗体的方法至少有20种，但得到广泛认可的是日本Takahashi等［3，4］和英国 Waters等［5］为提高 AQP4 抗体检测敏感性和特异性，率先建立的CBA法与FIPA法。其中，CBA法是在细胞表面进行观测，为定性检测;而FIPA法可定量测定AQP4抗体滴度。为建立可用于临床、定性定量检测血清AQP4抗体的方法并进一步评估AQP4抗体的临床意义，我们利用FIPA法对75例中枢神经系统脱髓鞘疾病患者进行了血清AQP4抗体检测，结果显示FIPA法检测NMOSD患者血清 AQP4抗体敏感性为 76.4%，特异性为100%，与国外 Waters等［5］报道大致相符，与 CBA相比，FIPA敏感性虽略低，但操作简单，可进行大样本、批量检测。

本研究发现在AQP4抗体阳性的NMOSD患者中，AQP4抗体FU值与患者脊髓受累长度呈正相关;对4例AQP4抗体阳性的患者抗体水平进行动态观察发现，患者在急性期甲强龙冲击、缓解期强的松和/或硫唑嘌呤治疗后，0.5～5个月患者血清AQP4抗体较为阴性。这与及Weinshenker［8］报道结果一致，提示NMOSD患者血清AQP4抗体FU值或抗体滴度水平可反映疾病是否处于急性期或再次复发，并可评估治疗效果。而血清AQP4抗体FU值与首次发病2年复发率及EDSS评分无相关性，这似乎与AQP4抗体为NMO致病性抗体相悖，考虑到EDSS主要适用于MS，提示临床需建立更适用于NMO疾病的病情评估系统。

综上所述，血清AQP4抗体检测可作为NMO与NVS鉴别的特异性血清学指标，血清AQP4抗体水平可判断疾病是否复发及评估治疗效果。

［1］Lennon VA，Wingerchuk DM，Kryzer TJ，et al.A serum antibody marker of neuromyelitis optica:distinction from multiple sclerosis［J］.Lancet，2004，364(9451):2106-2112.

［2］Wingerchuk DM，Lennon VA，Pittock SJ，et al.The spectrum of neuromyelitis optica［J］.Lancet Neurol，2007，6(9):805-815.

［3］Takahashi T，Fujihara K，Nakashima I，et al.Establishment of a new sensitive assay for anti-human aquaporin-4 antibody in neuromyelitis optica［J］.Tohoku J Exp Med，2006，210(4):307-313.

［4］Takahashi T，FUjihara K，Nakashima I，et al.Anti-aquaporin-4 antibody is involved in the pathogenesis of NMO:a study on antibody titre［J］.Brain，2007，130(Pt 5):1235-1243.

［5］Waters P，Jarius S，Vincent A，et al.Aquaporin-4 antibodies in neuromyelitis optica and longitudinally extensive transverse myelitis［J］.Arch Neurol，2008，65(7):913-919.

［6］Milo R，Miller A.Revised diagnostic criteria of multiple sclerosis［J］.Autoimmun Rev，2014，13(4-5):518-524.

［7］Jarius S，Wildemann B.AQP4 antibodies in neuromyelitis optica:diagnostic and pathogenetic relevance［J］.Nat Rev Neurol，2010，6(7):383-392.

［8］Weinshenker BG，Wingerchuk DM，Lennon VA，et al.Neuromyelitis optica IgG predicts relapse after longitudinally extensive transverse myelitis［J］.Ann Neurol，2006，59(3):566-569.