神经肽Y对原代大脑皮质神经元NMDA受体电流的影响及其机制探讨

李琦军，张淑丽，常军英，白玉娟，穆卫卢，贾东昭，王彦志，李炎

(1石家庄市第三医院，石家庄050011;2秦皇岛市骨科医院)

生理状态下，小胶质细胞在中枢神经系统发挥免疫监视功能，当其受到刺激后，IL-1β、TNF-α等细胞因子大量释放，导致神经元损伤［1，2］，其作用机理可能与激活 N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受体有关［3，4］。NMDA 受体本身是一种离子通道蛋白，其被激活后，离子通道开放，Ca2+、Na+、K+等阳离子进入细胞，尤其是Ca2+大量内流。离子的跨膜流动形成 NMDA受体电流(INMDA)，导致神经元损伤［5～7］。神经肽 Y(NPY)通过作用于其 Y1受体，抑制小胶质细胞过度激活和IL-1β、TNF-α表达，减轻神经元损伤。2012年6月～2014年3月，本研究观察了NPY对原代大脑皮质神经元INMDA的影响，并探讨其机制。

1 材料与方法

1.1 材料 新生24 h内SD大鼠60只，雌雄不限，清洁级;河北医科大学实验动物中心提供，动物生产许可证号SCXK(冀)2013-1-03。脂多糖(LPS，美国Sigma公司)，NPY Y1受体阻断剂 BIBP3226(美国Tocris Bioscience公司)，NPY(美国 ENZO公司)。三维操纵器、电极拉制器(美国 Sutter instruments company公司)，700B型膜片钳放大器(美国Axon公司)。

1.2 原代大脑皮质小胶质细胞培养及处理 取新生24 h内SD大鼠30只，无菌环境下开颅取大脑皮质，参照Nakajima等［8］方法进行原代小胶质细胞培养。对培养细胞进行免疫细胞化学荧光染色，证实小胶质细胞纯度＞95%，满足实验需要。将纯化好的小胶质细胞以1×105/mL接种于预铺多聚赖氨酸的6孔板内，3 mL/孔。培养3 d后换新鲜无血清胶质细胞培养液，培养12 h使细胞同步化。将细胞分为1、2、3、4组，每组5孔。1组以无血清胶质细胞培养液孵育6 h;2组以含终浓度为100 ng/mL LPS的无血清胶质细胞培养液孵育6 h;3组先以含NPY(1 μmol/L)的无血清胶质细胞培养液孵育0.5 h，然后加入LPS(100 ng/mL)继续孵育6 h;4组先用含BIBP3226(1 μmol/L)的无血清胶质细胞培养液孵育0.5 h，再加入 NPY(1 μmol/L)孵育 0.5 h，最后加入LPS(100 ng/mL)继续孵育6 h。

1.3 原代大脑皮质神经元培养及处理 取新生24 h内SD大鼠30只，无菌环境下开颅取大脑皮质，参照Yang等［9］方法进行原代神经元培养。对培养细胞进行免疫细胞化学荧光染色，证实神经元纯度＞95%，满足实验需要。将纯化好的神经元分为1、2、3、4组，每组5孔，分别加入相对应的小胶质细胞条件培养液，继续孵育神经元6 h。小胶质细胞培养液、神经元培养液体积比为1∶1。

1.4 神经元INMDA检测 混合培养液孵育神经元6 h后，采用标准全膜片钳技术记录神经元将各组神经元爬片取出，置于0.3 mL浴槽，采用细胞外液(2 mL/min)持续灌流细胞，保证液体交换在2 min内完成。倒置显微镜下观察细胞，选择轮廓清晰、立体感强、表面光滑的5个神经元进行封接实验。三维操纵器阻抗为1～3 MΩ。将灌充电极内液的玻璃微电极与细胞表面形成封接，加大负压至吸破细胞，补偿电容电流和电极串联电阻，形成全细胞记录。设置钳制电压为-60 mV。形成全细胞模式后稳定5 min，至细胞内液和电极内液完全置换。细胞外给予100 μmol/L NMDA 和10 μmol/L甘氨酸诱发电流发生内向型变化，此电流即INMDA。计算INMDA峰值电流的电流密度。

1.5 统计学方法 采用SPSS10.0统计软件。符合正态性和方差齐性要求的数据，采用完全随机设计的方差分析，两两比较采用LSD法。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

1、2 、3、4 组INMDA峰值电流密度分别为(23.19 ±1.29)、(38.91 ±3.29)、(27.09 ±2.58)、(35.56 ±3.92)Pa/Pf;与1组相比，2组电流密度增强(P＜0.05);与2组相比，3组电流密度降低(P＜0.05);与3组比较，4组电流密度上升(P＜0.05)。

3 讨论

小胶质细胞广泛分布于中枢神经系统，在中枢神经系统内行使免疫监视和防御功能，是脑内重要的免疫细胞。激活的小胶质细胞形态可从分支状变成圆形或阿米巴状，细胞内多种细胞因子的转录和表达也随之增高，释放各种生物活性物质。这些生物活性物质大量产生并积聚于中枢神经系统，对神经元产生毒性作用。LPS是由氨基甙组成的磷脂，是革兰阴性杆菌细胞壁的组成成分之一。LPS对神经元无明显影响，但对小胶质细胞有很强的激活作用。LPS激活后的小胶质细胞会生成多种生物活性物质，导致神经元损伤和凋亡。

NMDA是外源性NMDA受体选择性激动剂，与NMDA受体结合后，使细胞膜去极化，开放相应离子通道。甘氨酸是NMDA受体复合体的正性变构调制物。在甘氨酸存在的情况下，NMDA对NMDA受体的激活效应大大增加。因此，本研究中采用NMDA和甘氨酸共同作用，以激活NMDA受体。将各组小胶质细胞培养液和神经元培养液1∶1混合后孵育神经元，既保证了神经元细胞成活需要的各种营养成分，又能保持胶质细胞培养液中物质与神经元的有效接触。膜片钳技术检测结果显示，含LPS的培养液孵育小胶质细胞后，再用此培养液孵育神经元，神经元INMDA较1组增强;提示小胶质细胞激活引起神经元INMDA增强，被LPS活化后的小胶质细胞可以通过非直接接触途径增加神经元INMDA。提前在胶质细胞培养液中加入NPY，能够明显抑制LPS对小胶质细胞的激活作用，其培养液孵育的神经元INMDA增强幅度明显下降;说明NPY能够通过作用于小胶质细胞，抑制神经元INMDA过度增强。再加入NPY Y1受体阻断剂BIBP3226，NPY的上述作用消失;说明NPY通过激活其Y1受体来抑制神经元INMDA过度增高。但上述结果还需进一步研究以证实。

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