N-乙酰半胱氨酸预处理对心脏移植大鼠供心缺血再灌注损伤的影响及机制探讨

韩燕，李占清，王帅，邬鹏宇，崔翔宇，杨学慧，王耕银，杨方，郑素琴，伊雪( 华北理工大学基础医学院，河北唐山063000;华北理工大学附属医院)

N-乙酰半胱氨酸预处理对心脏移植大鼠供心缺血再灌注损伤的影响及机制探讨

韩燕1，李占清2，王帅2，邬鹏宇2，崔翔宇2，杨学慧2，王耕银2，杨方1，郑素琴1，伊雪1
( 1华北理工大学基础医学院，河北唐山063000;2华北理工大学附属医院)

摘要:目的观察N-乙酰半胱氨酸( NAC)预处理对心脏移植大鼠供心缺血再灌注损伤( IRI)的影响，并探讨其机制。方法60只健康雄性Lewis大鼠随机分为对照组、NAC供体预处理组、NAC受体预处理组各20只，每组10只分别作为心脏移植供体和受体。对照组、供体预处理组于摘取供体心脏前30 min经供体大鼠下腔静脉分别注射生理盐水0.5 mL、NAC 300 mg/kg，受体大鼠不处理;受体预处理组移植前30 min经受体大鼠下腔静脉注射NAC 300 mg/kg，供体大鼠不处理。三组均行同种异体异位心脏移植，移植后24 h摘取移植心脏。光镜、电镜下观察心肌组织学及超微结构变化，用免疫组化SABC法检测心肌组织中的Caspase-3蛋白。结果光镜、电镜下，NAC预处理组心肌损伤较对照组减轻; NAC受体预处理组Caspase-3蛋白表达量高于NAC供体预处理组和对照组( P均＜0.05)，NAC供体预处理组和对照组相比差异无统计学意义。结论NAC预处理可减轻心脏移植大鼠供心IRI程度，该作用与其抑制心肌细胞Caspase-3蛋白表达从而抑制细胞凋亡有关。

关键词:N-乙酰半胱氨酸;心脏移植;缺血再灌注损伤;半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3

心肌细胞凋亡、坏死是心肌缺血再灌注损伤( IRI)的重要机制［1］。N-乙酰半胱氨酸( NAC)是细胞内还原型谷胱甘肽的前体，可通过提高氧化酶活性减少心肌细胞损伤［2～5］，增加移植成功率。但是，NAC是否通过抗凋亡途径保护移植心脏，尚未见报道。2012年9月～2014年12月，我们观察了N-乙酰半胱氨酸( NAC)预处理对心脏移植大鼠供心凋亡蛋白Caspase-3表达水平的影响。现报告如下。

1　材料与方法

1.1动物分组及干预60只Lewis雄性大鼠(近交系，体质量200～220 g，由德国海德堡大学动物室提供，常规饲养)随机分为对照组、NAC供体预处理组、NAC受体预处理组各20只，每组10只分别作为心脏移植供体和受体。对照组、NAC供体预处理组供体大鼠摘取供心前30 min经下腔静脉分别注射生理盐水0.5 mL、NAC 300 mg/kg，受体大鼠不做任何处理; NAC受体预处理组受体大鼠于移植前30 min经下腔静脉注射NAC 300 mg/kg，供体大鼠不予处理。三组按文献［6］方法行同种异体异位心脏移植，移植后24 h摘取移植心脏。

1.2心肌组织学观察取各组移植心上小块左心室壁心肌组织置于4%甲醛溶液固定，常规脱色、石蜡包埋、切片，HE染色，光镜下观察心肌组织学变化。

1.3心肌组织超微结构观察于冰台上取1 mm× 1 mm×1 mm小块心肌组织，2.5%戊二醛固定，环氧树脂浸透、包埋、超薄切片，透射电镜观察心肌超微结构。

1.4心肌组织Caspase-3表达测定采用免疫组化SABC法。取心肌组织石蜡切片，二甲苯浸泡，梯度乙醇水化，用PBS( pH 7.4)冲洗2次。放入0.01 mol/L枸橼酸缓冲液，煮沸热修复抗原;经一抗、二抗处理，滴加试剂SABC;各步间均用PBS漂洗3次，DAB显色、自来水充分冲洗、复染、脱水、透明、封片。光镜下观察，Caspase-3阳性表达为心肌细胞细胞质中出现棕黄色颗粒［7］。阳性细胞百分比:无阳性细胞为0分，阳性细胞百分比1%～10%为1分，10%～50%为2分，50%～80%为3分，80%～100%为4分。阳性细胞染色强度:无阳性反应为0分，浅黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分。Caspase-3蛋白表达量用上述两项评分之积表示。

1.5统计学方法采用SPSS17.0统计软件。计量资料以珋x±s表示，组间比较采用单因素方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1心肌组织学变化对照组移植心心肌间质水

肿，内膜下有大量炎细胞弥漫浸润，间质小血管扩张、充血，血管壁增厚，周围炎细胞灶状浸润明显，心肌细胞萎缩、断裂，心肌损坏严重。NAC供体预处理组移植心心肌间质炎细胞浸润，心肌细胞肿胀较明显，心肌损伤较对照组轻。NAC受体预处理组移植心心肌组织中心肌间质散在炎细胞浸润，个别心肌细胞水肿，心内膜损伤较对照组和NAC供体预处理组轻。

2.2心肌超微结构变化对照组移植心心肌纤维排列紊乱，部分肌丝断裂、溶解，肌浆网扩大，线粒体肿胀，线粒体膜不清晰，见空泡形成。NAC供体预处理组移植心心肌纤维排列规则，少数线粒体肿胀，线粒体膜基本完整，见少量空泡形成。NAC受体预处理组移植心心肌纤维排列整齐，肌节明暗带清晰，线粒体排列整齐，线粒体膜完整。

2.3心肌组织Caspase-3蛋白表达NAC受体预处理组Caspase-3蛋白表达量( 2.10±0.29)高于NAC供体预处理组( 1.25±0.05)和对照组( 1.21± 0.07)，P均＜0.05; NAC供体预处理组和对照组比较，P＞0.05。

3　讨论

细胞凋亡是生理和病理情况下通过基因调控和酶促反应进行的细胞程序性死亡，是机体为维持内环境平衡的一种自我调节机制。细胞凋亡由许多细胞凋亡相关基因控制，凋亡诱导因素通过一系列的信号转导通路激活相关基因调控凋亡。Caspase家族是一类进化相对保守、在特异天冬氨酸之后切割靶蛋白的半胱氨酸蛋白酶，其中Caspase-3是凋亡过程中最重要的蛋白酶，是多种细胞凋亡途径的共同下游效应部分［7～9］。活化后的Caspase-3可切断天冬氨酸残基后肽键，导致细胞凋亡蛋白酶级联反应、DNA断裂，是细胞凋亡的主要效应因子［10～12］。

NAC是含有活性巯基的化合物，具有较强的抗炎、抗氧化作用，能干扰自由基生成、清除已生成的自由基、调节细胞的代谢活性。近年来，NAC在减轻心、肾、肺等脏器IRI中的作用日益受到重视［13～16］。本研究发现，对照组和NAC供体预处理组大鼠心肌组织炎性细胞浸润较NAC受体预处理组重，细胞坏死和凋亡较多，线粒体损伤较重; NAC受体预处理组Caspase-3蛋白表达量高于NAC供体预处理组和对照组，而NAC供体预处理组与对照组差异无统计学意义。因此，NAC预处理可减轻心脏移植大鼠供心IRI，该作用可能与其抑制Caspase-3蛋白表达从而抑制细胞凋亡有关。

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收稿日期:( 2015-02-10)

通信作者:伊雪

基金项目:河北省留学人员科技活动项目择优资助项目( 20100511)。

文章编号:1002-266X( 2015)30-0028-02

文献标志码:A

中图分类号:R654.2

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.30.010