喜炎平注射液联合头孢唑林对金黄色葡萄球菌感染小鼠外周血中性粒细胞和腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响研究

刘晓霞，陈剑华，王雪玲，熊南燕，霍忠超

·论著·

喜炎平注射液联合头孢唑林对金黄色葡萄球菌感染小鼠外周血中性粒细胞和腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响研究

刘晓霞，陈剑华，王雪玲，熊南燕，霍忠超

目的探讨喜炎平注射液联合头孢唑林对金黄色葡萄球菌感染小鼠外周血中性粒细胞和腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响。方法选取昆明种小鼠70只，经腹腔注射9×108/ml金黄色葡萄球菌菌液0．2 ml，选择其中出现明显发热反应小鼠40只，根据发热程度编号并随机分为空白对照组、头孢唑林组、喜炎平注射液组及联合用药组，每组10只;另选10只直肠温度正常小鼠作为正常对照组。正常对照组和空白对照组小鼠给予0．9%氯化钠溶液腹腔注射，头孢唑林组小鼠给予头孢唑林腹腔注射，喜炎平注射液组小鼠给予喜炎平注射液腹腔注射，联合用药组给予喜炎平注射液联合头孢唑林腹腔注射;各组小鼠均连续腹腔注射给药7 d。计算各组小鼠外周血中性粒细胞实际吞噬率、吞噬指数及腹腔巨噬细胞吞噬率、吞噬指数。结果空白对照组、头孢唑林组小鼠外周血中性粒细胞实际吞噬率、吞噬指数低于正常对照组，喜炎平注射液组、联合用药组小鼠外周血中性粒细胞实际吞噬率、吞噬指数高于空白对照组和头孢唑林组(P＜0．05)。空白对照组、头孢唑林组小鼠腹腔巨噬细胞吞噬率、吞噬指数低于正常对照组，喜炎平注射液组、联合用药组小鼠腹腔巨噬细胞吞噬率、吞噬指数高于空白对照组和头孢唑林组(P＜0．05)。结论喜炎平注射液联合头孢唑林可促进金黄色葡萄球菌感染小鼠外周血中性粒细胞和腹腔巨噬细胞吞噬功能恢复正常，继而增强机体抗感染能力及药物杀菌作用。

葡萄球菌感染;金黄色葡萄球菌;小鼠;粒细胞;巨噬细胞;细胞吞噬作用;喜炎平注射液;头孢唑林

刘晓霞，陈剑华，王雪玲，等．喜炎平注射液联合头孢唑啉对金黄色葡萄球菌感染小鼠外周血中性粒细胞和腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响研究［J］．实用心脑肺血管病杂志，2015，23(4):54-57．［www．syxnf．net］

Liu XX，Chen JH，Wang XL，et al．Impact of xiyanping injection combined with and cefazolin on cytophagocytosis of neutrophils in peripheral blood and macrophages in enterocoelia in mice with staphylococcus aureus infection［J］．Practical Journal of Cardiac Cerebral Pneumal Vascular Disease，2015，23(4):54-57．

抗生素的问世具有划时代意义，其作为临床治疗感染性疾病的常用药，在多种微生物所致疾病的治疗中发挥着重要作用，但随着抗生素的广泛使用甚至滥用，细菌耐药现象越来越严重，抗生素使用剂量随之增大，但疗效却未随之明显提高。为提高抗生素疗效及缩短疗程，临床上常将一些具有清热解毒、抗菌消炎等作用的中药制剂与抗生素联合用于治疗感染性疾病，大量临床研究表明，抗生素与中药制剂联合应用治疗感染性疾病具有协同作用［1-4］。本研究旨在探讨喜炎平注射液联合头孢唑林对金黄色葡萄球菌感染小鼠外周血中性粒细胞和腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响，为临床联合应用中药制剂与抗生素治疗感染性疾病提供实验依据。

1 材料与方法

1．1 实验动物昆明种小鼠70只，雌雄各半，周龄6～8周，体质量18～22 g。

1．2 试剂及菌株异硫氰酸荧光素(FITC)为Solarbio公司产品，红细胞裂解液为天津灏洋生物制品有限公司产品，肝素为湖北康宝泰精细化工有限公司产品，可溶性淀粉购自北京博润莱特科技有限公司;金黄色葡萄球菌敏感菌株26001-25、金黄色葡萄球菌标准菌株ATCC25923、大肠埃希菌应用菌株44102-3a7均购自北京市药品生物制品检定所。

1．3 制备1%鸡红细胞悬液及6%可溶性淀粉肉汤溶液采鸡心脏血，用肝素抗凝，2 500 r/min离心5 min，取沉淀红细胞用0．9%氯化钠溶液洗涤3次，再用0．9%氯化钠溶液按体积配成1%鸡红细胞悬液备用;取肉汤培养基100 m l，加入可溶性淀粉6 g，混匀，水浴、煮沸、消毒，制成6%可溶性淀粉肉汤溶液备用。

1．4 造模方法及动物分组所有小鼠于实验前用电子体温计测量两次直肠温度，间隔时间为1 h，选择两次测量直肠温度相近小鼠，给予每只小鼠经腹腔注射9× 108/ml金黄色葡萄球菌菌液0．2 ml，1 h后再次测量直肠温度，选择出现明显发热反应小鼠40只，根据发热程度编号并随机分为空白对照组、头孢唑林组、喜炎平注射液组及联合用药组，每组10只;另选10只直肠温度正常小鼠作为正常对照组。正常对照组和空白对照组小鼠给予0．9%氯化钠溶液腹腔注射，70 mg/kg，2次/ d;头孢唑林组小鼠给予头孢唑林腹腔注射，70 mg/kg，2次/d;喜炎平注射液组小鼠给予喜炎平注射液腹腔注射，13 mg/kg，2次/d;联合用药组给予喜炎平注射液联合头孢唑林腹腔注射，用量同上。各组小鼠均连续腹腔注射给药7 d。

1．5 外周血中性粒细胞吞噬功能检测

1．5．1 FITC标记菌液培养16～18 h后取对数生长期大肠埃希菌，3 000 r/min离心15 min，用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤2次，再用碳酸盐缓冲液(CB，pH值9．5)配成浓度为0．5×109/ml细菌悬液，加入1 mg/m l FITC溶液使菌液终浓度达到5 μg/ml，37℃孵育2 h，3 000 r/min离心15 min后弃上清液，PBS洗涤2次，在用PBS配成1×109/ml细菌悬液。

1．5．2 流式细胞仪检测方法各组小鼠于最后一次给药后2 h采集球后静脉丛0．8～1 ml，肝素抗凝;在两支流式管中分别加入抗凝血100 μl和FITC标记菌液20 μl，混匀后将其中1支流式管37℃水浴15 min，另1支流式管0℃水浴15 min;水浴完成后迅速取出流式管并放入冰中10 min，加入冷PBS 2 m l，1 500 r/min离心10 min，弃上清液，加入红细胞裂解液2 ml，室温放置5 min，1 500 r/min离心10 min，弃上清液;加入冷PBS 2 m l洗涤2次，离心，弃上清液，PBS重悬细胞(至少包含10 000个细胞)，采用流式细胞仪进行检测，计算外周血中性粒细胞实际吞噬率及吞噬指数。中性粒细胞吞噬率(%)=(吞噬细菌的中性粒细胞数/总细胞数) ×100%，中性粒细胞实际吞噬率(%)=37℃中性粒细胞吞噬率-0℃中性粒细胞吞噬率，中性粒细胞吞噬指数=荧光强度/总细胞数。

1．6 腹腔巨噬细胞功能检测各组小鼠于第4次给药后经腹腔注射6%可溶性淀粉肉汤溶液1 ml，于最后一次给药后1．5 h经腹腔注射1%鸡红细胞悬液0．5 ml，再于30 min后收集腹腔液，涂片，经瑞氏染色后镜检;每张涂片计数200个巨噬细胞，且每张涂片重复计数3次取平均值;计算腹腔巨噬细胞吞噬率和吞噬指数:腹腔巨噬细胞吞噬率(%)=(吞噬鸡红细胞的巨噬细胞数/200)×100%，吞噬指数=吞噬细胞吞噬的鸡红细胞数/200。

1．7 统计学方法应用SPSS 16．0统计软件进行数据分析，计量资料以(±s)表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用q检验。以P＜0．05为差异有统计学意义。

2 结果

2．1 外周血中性粒细胞吞噬功能各组小鼠外周血中性粒细胞实际吞噬率、吞噬指数比较，差异有统计学意义(P＜0．05);空白对照组、头孢唑林组小鼠外周血中性粒细胞实际吞噬率、吞噬指数低于正常对照组，喜炎平注射液组、联合用药组小鼠外周血中性粒细胞实际吞噬率、吞噬指数高于空白对照组和头孢唑林组，差异均有统计学意义(P＜0．05，见表1、图1)。

表1 5组小鼠外周血中性粒细胞吞噬功能比较(±s)Table 1 Comparison of cytophagocytosis of neutrophils in peripheral blood among the five groups of mice

表1 5组小鼠外周血中性粒细胞吞噬功能比较(±s)Table 1 Comparison of cytophagocytosis of neutrophils in peripheral blood among the five groups of mice

注:与正常对照组比较，*P＜0．05;与空白对照组比较，△P＜0．05;与头孢唑林组比较，▲P＜0．05

组别只数实际吞噬率(%) 10 6．83±2．42 3．28±1．04空白对照组10 3．54±1．49*1．15±0．86*头孢唑林组10 2．66±1．73*1．47±0．43*喜炎平注射液组10 5．45±1．70△▲2．95±0．93△▲联合用药组10 6．88±1．84△▲3．16±0．91△▲F吞噬指数正常对照组0．000 0．000 10．57 13．79 P值值

图1 5组小鼠外周血中性粒细胞37℃时细胞吞噬率流式细胞仪检测结果Figure 1 Flow cytometer detection results of phagocytotic rate of neutrophil in peripheral blood among the five groups of mice(37℃)

2．2 腹腔巨噬细胞吞噬功能各组小鼠腹腔巨噬细胞吞噬率、吞噬指数比较，差异有统计学意义(P＜0．05);空白对照组、头孢唑林组小鼠腹腔巨噬细胞吞噬率、吞噬指数低于正常对照组，喜炎平注射液组、联合用药组小鼠腹腔巨噬细胞吞噬率、吞噬指数高于空白对照组和头孢唑林组，差异均有统计学意义(P＜0．05，见表2、图2)。

表2 5组小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能比较(±s)Table 2 Comparison of cytophagocytosis of macrophages in enterocoelia among the five groups of mice

表2 5组小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能比较(±s)Table 2 Comparison of cytophagocytosis of macrophages in enterocoelia among the five groups of mice

注:与正常对照组比较，*P＜0．05;与空白对照组比较，△P＜0．05;与头孢唑林组比较，▲P＜0．05

组别只数吞噬率(%) 10 62．95±9．25 1．88±0．67空白对照组10 47．10±10．28*1．08±0．32*头孢唑林组10 48．90±5．78*1．12±0．75*喜炎平注射液组10 60．30±9．74△▲1．79±0．61△▲联合用药组10 59．40±7．99△▲2．03±0．52△▲F吞噬指数正常对照组0．002 0．001 6．77 5．68 P值值

图2 小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞前后变化(瑞氏染色，×400)Figure 2 Changes of macrophagus before and after phagocytosis of chicken erythrocyte

3 讨论

喜炎平注射液的主要成分为穿心莲内酯磺化物，具有清热解毒、抗菌消炎等作用，临床上主要用于治疗上呼吸道感染、支气管炎、病毒性肺炎、小儿腹泻、细菌性痢疾等，常与抗生素联合使用［5-6］。本研究前期进行的体外研究发现，喜炎平注射液可增强头孢类抗生素的抗菌作用［7］，本研究旨在探讨喜炎平注射液联合头孢唑林对金黄色葡萄球菌感染小鼠中性粒细胞和巨噬细胞吞

噬功能的影响。

机体主要通过固有免疫应答和特异性免疫应答而发挥抗感染作用，其中固有免疫应答可在病原体入侵机体早期迅速反应，及时清除病原体。吞噬细胞是固有免疫应答的主要细胞，包括中性粒细胞、单核细胞和巨噬细胞。中性粒细胞在骨髓发育成熟后进入血液，约占白细胞总数的55%～70%，具有趋化、吞噬、呼吸爆发等生物学特性。当病原体进入机体后，中性粒细胞活化并在趋化因子诱导下穿过血管内皮细胞而进入血管间隙，继而迁移至感染部位，与病原体接触后形成伪足并将病原体包围，中性粒细胞质膜逐渐内陷形成吞噬体，继而发挥杀灭作用［8］。因此，吞噬是中性粒细胞杀灭病原体的前提条件，也是中性粒细胞发挥抗感染作用的关键。本研究结果显示，空白对照组、头孢唑林组小鼠外周血中性粒细胞实际吞噬率、吞噬指数低于正常对照组，喜炎平注射液组、联合用药组小鼠外周血中性粒细胞实际吞噬率、吞噬指数高于空白对照组和头孢唑林组，提示金黄色葡萄球菌感染可导致外周血中性粒细胞吞噬功能受抑制，而头孢唑林虽可杀灭金黄色葡萄球菌，但不能有效改善外周血中性粒细胞吞噬功能，喜炎平注射液及其与头孢唑林联合应用可减轻外周血中性粒细胞吞噬功能受抑制程度，促进外周血中性粒细胞吞噬功能恢复正常。

巨噬细胞由血液中单核细胞穿出血管后分化而成，分布于全身各处组织，可分为定居巨噬细胞和游走巨噬细胞两大类，其中定居巨噬细胞主要在相应组织器官发挥抗感染作用。当机体发生感染时，在病原体和细胞因子等刺激下血液中单核细胞大量穿出血管并分化为巨噬细胞，即游走巨噬细胞，而游走巨噬细胞不仅具有非特异性防御功能，可不断清除体内衰老、死亡及变异细胞，还具有激活特异性免疫应答作用，可处理和提呈抗原，而巨噬细胞的这些作用均需通过其吞噬功能来完成，因此，巨噬细胞的吞噬功能直接关系着其抗感染作用［8］。本研究结果显示，空白对照组、头孢唑林组小鼠腹腔巨噬细胞吞噬率、吞噬指数低于正常对照组，喜炎平注射液组、联合用药组小鼠腹腔巨噬细胞吞噬率、吞噬指数高于空白对照组和头孢唑林组，提示金黄色葡萄球菌感染可导致腹腔巨噬细胞吞噬功能降低，而头孢唑林不能有效恢复其吞噬功能，喜炎平注射液及其与头孢唑林联合应用可促进腹腔巨噬细胞吞噬功能恢复正常，继而增强机体抗感染能力。

综上所述，喜炎平注射液联合头孢唑林可促进金黄色葡萄球菌感染小鼠外周血中性粒细胞和腹腔巨噬细胞吞噬功能恢复正常，继而增强机体抗感染能力及药物杀菌作用，这为临床联合应用中药制剂与抗生素治疗感染性疾病提供了实验依据。

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［8］窦肇华，张远强，郭顺根．免疫细胞学与疾病［M］．北京:中国医药科技出版社，2009．

Im pact of Xiyanping Injection Combined w ith Cefazolin on Cytophagocytosis of Neutrophils in Peripheral Blood and M acrophages in Enterocoelia in M ice w ith Staphylococcus Aureus Infection

LIU Xiao-xia，CHEN Jian-hua，WANG Xue-ling，et al．
Medical College of Hebei University of Engineering，Handan 056002，China

Objective To investigate the impact of xiyanping injection combined with cefazolin on cytophagocytosis of neutrophils in peripheral blood and macrophages in enterocoelia in mice with Staphylococcus aureus infection．M ethods A total of 60 Kunming mice were selected at first，all of them were given intraperitoneal injection of Staphylococcus aureus bacteria liquid at dose of 0．2 m l(9×108/ml)，and then 40 mice with obvious fever were selected and randomly divided into groups A，B，C，D，each of 10 mice．A total of 10 mice with normal rectal temperature were selected as control group．Mice of control group and A group were given intraperitoneal injection of 0．9%sodium chloride injection，mice of B group were given intraperitoneal injection of cefazolin，mice of C group were given intraperitoneal injection of xiyanping injection，mice of D group were given intraperitoneal injection of xiyanping injection combined with cefazolin;all of the five groups were continuously injected for 7 days．Actual phagocytosis rate and phagocytic index of neutrophils in peripheral blood，phagocytosis rate and phagocytic index of macrophages in enterocoelia were calculated．Results Actual phagocytosis rate and phagocytic index of neutrophils in peripheral

Staphylococcal infections;Staphylococcus aureus;Mice;Granulocytes;Macrophages; Cytophagocytosis;Xiyanping injection;Cefazolin

R 515．9

A

10．3969/j．issn．1008-5971．2015．04．016

2014-12-02;

2015-03-10)

(本文编辑:鹿飞飞)

河北省科技支撑计划项目(12276104D-63)

056002河北省邯郸市，河北工程大学医学院(刘晓霞，陈剑华，王雪玲，熊南燕);河北工程大学临床医学院(霍忠超)

王雪玲，056002河北省邯郸市，河北工程大学医学院;E-mail:wangxuelingcool@126．com

blood，phagocytosis rate and phagocytic index of macrophages in enterocoelia of groups A and B were statistically significantly lower than those of control group(P＜0．05)，those of groups C and D were statistically significantly higher than those of groups A and B(P＜0．05)．Conclusion Xiyanping injection combined with cefazolin can promote the recovery of cytophagocytosis of neutrophils in peripheral blood and macrophages in enterocoelia in mice with Staphylococcus aureus infection，improve the body' s resistance to infection and the drugs'disinfection effect．