高效液相色谱法测定不同产地的昆仑雪菊中绿原酸和芦丁含量比较研究

杜 鹃，吴忠红

(1.新疆农业职业技术学院 园林科技学院，新疆 昌吉 831100；2.新疆农业科学院 农产品贮藏加工所，新疆 乌鲁木齐 830091)

0 引言

雪菊[1-2]是生长在海拔3 200 m 以上的雪山之隅及喀喇昆仑山脉的野生蛇目菊，所以又称昆仑雪菊、天山雪菊，其花期极短、产量极低，是目前新疆唯一与雪莲齐名、具有独特功效的稀有高寒植物.长期以来，昆仑雪菊被新疆和田当地居民当花茶饮用，可治疗燥热烦渴、高血压、心慌、胃肠不适、食欲不振、痢疾及疮疖肿毒.近年来，雪菊以其突出的降血压、降血脂功能，成为茶界新宠，身价暴增，目前在新疆和田、喀什、达坂城开始产业化种植，已经形成20/15 万hm2种植面积.雪菊中主要的功能性成分是绿原酸、芦丁，目前对于不同产地、不同海拔雪菊的单体活性成分尚无系统定性和定量的分析，关于两者间活性成分的对比也未见报道.探明不同海拔的雪菊在功能成分上的差异，对于实现雪菊的分级加工，开发具有保健价值的食品添加剂或功能食品，提高雪菊资源的综合利用率，有着重要的经济价值和社会价值.

1 材料与方法

1.1 材料与设备

3 个不同地点的昆仑雪菊样品分别为新疆和田皮山县克里阳高原雪菊（生长海拔3 200 m 左右）、新疆喀什高原雪菊（生长海拔2 000 m 左右）、新疆达坂城平原雪菊（生长海拔1 000 m 左右）.50 ℃烘干至恒质量，粉碎，过60 目筛，储藏备用.

绿原酸、芦丁均由上海金穗生物有限公司提供.

乙醇、氯化铝、醋酸、醋酸钠均为分析纯，磷酸为优级纯，甲醇、乙腈为色谱纯.

Agilent Technologies 1 200 Seris 高效液相色谱仪：安捷伦科技有限公司；GDYQ-721S 型超声波辅助快速提取仪：长春吉大小天鹅仪器设备有限公司；FA2004 电子天平：上海仪器天平厂；722 型可见分光光度计：上海光谱仪器分析有限公司；DHG-9053A 型电热恒温鼓风干燥箱：上海精宏实验设备有限公司.

1.2 试验方法

1.2.1 供试样品溶液的制备

采用超声波提取法[3-4].将3 种雪菊样品粉碎，过60 目筛，分别称取干燥的昆仑雪菊粉各1 g，加50%甲醇水溶液20 mL，超声波提取30 min，冷却后用50%甲醇水溶液定容至25 mL，经0.22μm的滤膜过滤，滤液供HPLC 分析.

1.2.2 芦丁标准曲线的绘制

精确称取120 ℃干燥至恒质量的芦丁对照品105.8 mg，置于100 mL 容量瓶中，用少量甲醇加热溶解，冷却后甲醇定容至刻度，摇匀，即得质量浓度为1.058 mg/mL 的芦丁标准品溶液.分别精确吸取上述芦丁标准液0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0 mL 于25 mL 的容量瓶中，加入1.5%AlCl38 mL 和醋酸-醋酸钠的缓冲液(pH 5.5)4 mL，并用50%乙醇水溶液定容至刻度，摇匀，静置0.5 h.以不加芦丁为空白对照，在415 nm 波长下测定吸光度，以吸光度值为纵坐标，以显色液中芦丁的浓度为横坐标，用最小二乘法进行回归，线性方程为A=0.000 638+0.862 3C，R2=0.999 4.结果表明，芦丁标准品溶液的质量浓度在15.3～59.75 μg/mL 范围内与吸光度的线性关系良好.

1.2.3 总黄酮含量测定

采用AlCl3分光光度比色法[5-7].取1.0 mL 样品溶液于10 mL 容量瓶，以不加样品的溶液做空白，按1.2.2 的条件测定吸光度，参照标准曲线计算浓度，平行测定3 次，取平均值.

1.2.4 色谱条件[8-9]

色 谱 柱：CNW Athena -C18 柱250 mm ×4.6 mm，5 μm；流动相：甲醇-0.4%磷酸（A-B）梯度洗脱；梯度洗脱方法：0～30 min，A-B(30∶50～70∶50)线性 梯 度 洗 脱，30～40 min，A-B（30 ∶70)；柱 流 量：1.0 mL/min；柱温40 ℃；检测波长340 nm；进样量10 μL；外标法.根据样品的出峰保留时间比对标样的保留时间，测定3 个雪菊样品中绿原酸、芦丁的含量.

1.2.5 混合对照品储备液的制备

分别精确称取绿原酸和芦丁对照品适量，加甲醇制成混合对照品溶液，得绿原酸质量浓度为20 μg/mL，芦丁质量浓度为40 μg/mL 的混合对照品溶液.

2 结果与分析

2.1 不同产地雪菊总黄酮含量的比较

通过比较不同产地的雪菊样品总黄酮含量可得，3 种不同产地雪菊总黄酮含量具有明显差异，和田高原雪菊总黄酮含量最高为132.58 μg/mL，喀什高原雪菊为126.63 μg/mL，达坂城平原雪菊总黄酮含量最低仅有99.47 μg/mL.

2.2 不同产地雪菊的绿原酸和芦丁HPLC 定性和定量分析

由图1—图4 可知，在本色谱条件下，不同产地雪菊中绿原酸和芦丁的色谱峰与其他组分峰得到较好分离，不同产地海拔的雪菊之间的活性成分物质图谱相似，共有峰较多，说明几种雪菊的活性成分组成基本一样，差别主要是活性成分含量的多少[10-12].

图1 绿原酸、芦丁标准品图谱Fig.1 Chlorogenic acid，rutin standard chromatagran

图2 和田高原雪菊绿原酸、芦丁图谱Fig.2 Chlorogenic acid and rutin chromatogram of Hotan Coreopsis timctoria

图3 喀什高原雪菊绿原酸、芦丁图谱Fig.3 Chlorogenic acid and rutin chomatogram ofKashgar Coreopsis timctoria

图4 达坂城平原雪菊绿原酸、芦丁图谱Fig.4 Chlorogenic acid and rutin chromatogram of Dabancheng Corepsis timctoria

由表1 可知，不同产地、海拔的雪菊的绿原酸和芦丁均有差异，其中绿原酸的含量随海拔升高而降低，达坂城1 000 m 平原雪菊最高0.255%，而高海拔3 000 m 和田产雪菊最低只有0.175%；芦丁含量的增加趋势与绿原酸恰好相反，随生长海拔升高呈增加趋势，生长在海拔3 000 m 以上的和田雪菊芦丁含量高达0.645%，而达坂城1 000 m雪菊只有0.475%.说明雪菊中绿原酸、芦丁等功能性成分含量会受地域、栽培条件（土壤、地形等）、气候条件（光照、降雨、温度等）等多种因素的影响.

表1 不同产地的雪菊绿原酸和芦丁含量比较Table 1 Comparison of chlorogenic acid and rutin content in Coreopsis timctoria of different areas

3 结论

在所测定的不同产地和海拔的3 种雪菊中，和田高原雪菊的总黄酮含量最高，高达132.58 μg/mL，喀什高原雪菊为126.63 μg/mL，达坂城平原雪菊的总黄酮含量最低，仅有99.47 μg/mL.雪菊中活性成分的组成非常相似，但是含量却有明显差异，其中绿原酸的含量随海拔升高有降低趋势，芦丁含量随海拔增加有升高趋势.

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