新疆地区维吾尔族和汉族晚期非小细胞肺癌患者三磷酸腺苷结合盒转运体C2基因多态性差异研究

韩志刚，陶洁，王强，单莉

·论著·

新疆地区维吾尔族和汉族晚期非小细胞肺癌患者三磷酸腺苷结合盒转运体C2基因多态性差异研究

韩志刚，陶洁，王强，单莉

目的探讨新疆地区维吾尔族和汉族晚期非小细胞肺癌(NSCLC)患者三磷酸腺苷结合盒转运体C2 (ABCC2)基因多态性差异。方法选择2013年3月—2014年8月就诊于新疆医科大学附属肿瘤医院肺内一科的晚期NSCLC患者226例，其中维吾尔族110例(A组)，汉族116例(B组)，采用限制性片段长度多态性聚合酶链式反应检测ABCC2基因rs717620、rs2273697、rs3740066位点多态性。结果两组患者ABCC2基因rs717620位点基因型及等位基因分布频率比较，差异均有统计学意义(P＜0.05);而两组患者ABCC2基因rs2273697、rs3740066位点基因型及等位基因分布频率比较，差异均无统计学意义(P＞0.05)。两组腺癌患者ABCC2基因rs717620位点基因型和等位基因分布频率比较，差异有统计学意义(P＜0.05)。两组鳞癌患者ABCC2基因rs717620位点基因型和等位基因分布频率比较，差异无统计学意义(P＞0.05)。两组ⅢB、Ⅳ期患者ABCC2基因rs717620位点基因型和等位基因分布频率比较，差异均有统计学意义(P＜0.05)。结论新疆地区维吾尔族、汉族晚期NSCLC患者ABCC2基因rs2273697、rs3740066位点多态性无明显差异，而rs717620位点多态性存在差异。

癌，晚期非小细胞肺;三磷酸腺苷结合盒转运体C2;基因多态性;维吾尔族;汉族

韩志刚，陶洁，王强，等.新疆地区维吾尔族和汉族晚期非小细胞肺癌患者三磷酸腺苷结合盒转运体C2基因多态性差异研究［J］.实用心脑肺血管病杂志，2015，23(3):38－42.［www.syxnf.net］

Han ZG，Tao J，Wang Q，et al.Differences of genetic polymorphisms of gene ABCC2 between Uygur and Han patients with advanced non－small cell lung cancer in Xinjiang［J］.Practical Journal of Cardiac Cerebral Pneumal and Vascular Disease，2015，23(3):38－42.

三磷酸腺苷结合盒转运体C2(ABCC2)又名多药耐药相关蛋白2(multidrug resistance－associated protein 2，MRP2)或小管多种有机阴离子转运体(canalicular multispecific organic anion transporter，cMOAT)，其是一种膜转运蛋白，属于ABC转运体中C亚家族中的一员。人类ABCC2基因定位于染色体10q24，共有32个外显子，在基因组DNA中长度约200 kb;ABCC2蛋白质由1 545个氨基酸组成，含有17个跨膜螺旋结构，构成了3个跨膜结构域。ABCC2具有阻止化疗药物进入细胞内的作用，是药物代谢转运通路中的主要基因，其机制与ABCC2自身的生物学作用有关，ABCC2把药物从细胞内泵出细胞以降低细胞内药物浓度和减轻细胞毒性作用，进而使机体对铂类等药物产生耐药。Ito等［1］研究发现，ABCC2基因的6个变异中C－24T、G1249A和C3972T等位基因分布频率分别是18.8%、12.5%和21.9%，因其分布频率较高而成为ABCC2基因多态性研究的重点，另外3个变异(C2302T、C2366T和G4348A)的分布频率均小于1%。因此，本研究选择ABCC2基因rs717620、rs2273697、rs3740066位点进行多态性分析，探讨其在新疆地区维吾尔族、汉族晚期非小细胞肺癌(non－small－cell lung cancer，NSCLC)患者中的分布特征，旨在为后续有关不同民族NSCLC的治疗提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料选择2013年3月—2014年8月就诊于新疆医科大学附属肿瘤医院肺内一科的晚期NSCLC患者226例，均经病理检查确诊，其中维吾尔族110例(A组)和汉族116例(B组)，两组患者性别、年龄、病理类型、TNM分期及吸烟率比较，差异均无统计学意义(P＞0.05，见表1)。

1.2 实验方法

1.2.1 主要实验仪器及试剂聚合酶链反应(PCR)扩增仪(加拿大BBI公司);SW－CJ－1D洁净工作台(江苏苏洁净化设备厂);DK－8D型电热恒温水槽(上海森信实验仪器有限公司);DYY－8型稳压稳流电泳仪(上海琪特分析仪器有限公司);YXJ－2离心机(湘仪离心机仪器有限公司);H6－1微型电泳槽(上海精益有机玻璃制品仪器厂);凝胶成像系统(Gene Genius公司);U－3010紫外－可见分光光度计(Hitachi公司);移液器(范围100～1 000 L，20～200 L，0.5～10 L)(加拿大BBI公司);Taq DNA聚合酶、10×PCR Buffer〔无Mg2+:100 mM Tris－HCl，pH值8.8，25℃;500 mM KCl，0.8%(v/v)Nonidet〕; MgCl2(25 mM)、蒸馏水(dH2O)(10 mM)、Marker (BBI)、6×DNA Loading Dye(上海生工);PCR产物纯化回收试剂盒(上海生工SK1141);限制性内切酶(MBI)。

表1 两组患者一般资料比较Table 1 Comparison of general information between two groups

1.2.2 DNA提取及PCR扩增抽取226例晚期NSCLC患者外周静脉血3 ml加入EDTA抗凝试管内，全血于－80℃低温冰箱保存备用。应用全血DNA快速提取试剂盒(离心柱型)提取DNA。采用PCR扩增仪扩增DNA，所用ABCC2基因引物序列见表2。PCR反应体系15 μl中含10×PCR Buffer 1.5 μl，引物F 0.2 μl，引物R 0.2μl，脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)0.4 μl，Taq DNA聚合酶0.1 μl，dH2O 11 μl。PCR反应条件:95℃预变性5 min，95℃30 s，68℃45 s，72℃60 s，共20个循环;95℃30 s，58℃30 s，72℃40 s，共20个循环;72℃延伸7 min。

1.2.3 酶切分型采用限制性片段长度多态性聚合酶链式反应(PCR－RFLP)检测ABCC2基因rs717620、rs2273697、rs3740066位点多态性。rs717620、rs3740066采用TaqI酶切分型，15 μl反应体系中包括PCR反应产物10 μl，10×Buffer R 1.5 μl，TaqI限制性内切酶0.1 μl，dH2O 3.4 μl，7℃水浴12 h，质量分数3%琼脂糖凝胶，150 V电泳30 min，然后观察DNA条带。rs2273697采用NcoI酶切分型，15 μl反应体系中包括PCR反应产物10 μl，10×Buffer R 1.5 μl，NcoI限制性内切酶0.1 μl，dH2O 3.4 μl，7℃水浴12 h，质量分数3%琼脂糖凝胶，150 V电泳30 min，然后分析酶切产物。

1.3 统计学方法应用SPSS 17.0统计学软件进行数据处理，采用Hardy－Weinberg遗传平衡检验样本的群体代表性;组间基因型及等位基因分布频率比较采用χ2检验，以OR(95%CI)表示基因突变率差异;计量资料以(x±s)表示，采用两独立样本t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Hardy－Weinberg遗传平衡检验两组患者ABCC2基因rs717620位点基因型分布频率符合Hardy－Weinberg遗传平衡(χ2=2.238，P=0.327;χ2= 0.665，P=0.717)，rs2273697位点基因型分布频率符合Hardy－Weinberg遗传平衡(χ2=0.015，P=0.992; χ2=0.331，P=0.848)，rs3740066位点基因型分布频率也符合Hardy－Weinberg遗传平衡(χ2=0.512，P= 0.774;χ2=0.405，P=0.817)，表明研究对象的选择无遗传学偏移，该群体基因遗传平衡，具有较好的群体代表性。

2.2 ABCC2基因分型

2.2.1 ABCC2基因rs717620位点PCR扩增产物片段长度为139 bp，CC基因型为野生纯合子，可见100 bp、39 bp两种片段;CT基因型为杂合子，可见139 bp、100 bp、39 bp 3种片段;TT基因型为突变纯合子，可见139 bp一种片段(见图1)。

图1 ABCC2基因rs717620位点基因多态性PCR－RFLP电泳图Figure 1 PCR－RFLP electrophoresis of polymorphism of ABCC2 gene rs717620

2.2.2 ABCC2基因rs2273697位点PCR扩增产物片段长度为239 bp，GG基因型为野生纯合子，可见239 bp、95 bp两种片段;AG基因型为杂合子，可见239 bp、95 bp、69 bp、26 bp 4种片段，AA基因型为突变纯合子，可见239bp、69bp、26bp 3种片段(见图2)。

2.2.3 ABCC2基因rs3740066位点PCR扩增产物片段长度为132 bp，CC基因型为野生纯合子，可见90 bp、42 bp两种片段;CT基因型为杂合子，可见132 bp、90 bp、42 bp 3种片段;TT基因型为突变纯合子，可见132 bp一种片段(见图3)。

图2 ABCC2基因rs2273697位点基因多态性PCR－RFLP电泳图Figure 2 PCR－RFLP electrophoresis of polymorphism of ABCC2 gene rs2273697

图3 ABCC2基因rs3740066位点多态性PCR－RFLP电泳图Figure 3 PCR－RFLP electrophoresis of polymorphism of ABCC2 gene rs3740066

2.3 两组患者基因型分布因ABCC2基因各位点突变纯合子基因型例数较少，且突变纯合子和杂合子均属于突变基因型，因此将其与杂合子型合并。两组患者ABCC2基因rs717620位点基因型及等位基因分布频率比较，差异均有统计学意义(P＜0.05);而两组患者ABCC2基因rs2273697、rs3740066位点基因型及等位基因分布频率比较，差异均无统计学意义(P＞0.05，见表3)。

表3 两组患者ABCC2基因rs717620、rs2273697和rs3740066位点基因型及等位基因分布频率比较〔n(%)〕Table 3 Comparison of genotypes and alleles frequencies of gene ABCC2 rs717620，rs2273697 and rs3740066 between the two groups

2.4 两组不同病理类型患者ABCC2基因rs717620位点基因型和等位基因分布频率比较两组腺癌患者ABCC2基因rs717620位点基因型和等位基因分布频率比较，差异有统计学意义(P＜0.05，见表4)。两组鳞癌患者ABCC2基因rs717620位点基因型和等位基因分布频率比较，差异无统计学意义(P＞0.05，见表5)。

表4 两组腺癌患者ABCC2基因rs717620位点基因型及等位基因分布频率比较Table 4 Comparison of genotypes and alleles frequencies of gene ABCC2 rs717620 of patients with adenocarcinoma between the two groups

表5 两组鳞癌患者ABCC2基因rs717620位点基因型及等位基因分布频率比较〔n(%)〕Table 5 Comparison of genotypes and alleles frequencies of gene ABCC2 rs717620 of patients with squamous carcinomas between the two groups

2.5 两组不同TNM分期患者ABCC2基因rs717620位点基因型和等位基因分布频率比较两组ⅢB、Ⅳ期患者ABCC2基因rs717620位点基因型和等位基因分布频率比较，差异均有统计学意义(P＜0.05，见表6～7)。

表6 两组ⅢB期患者ABCC2基因rs717620位点基因型及等位基因分布频率比较〔n(%)〕Table 6 Comparison of genotypes and alleles frequencies of gene ABCC2 rs717620 of patients withⅢB stage between the two groups

表7 两组Ⅳ期患者ABCC2基因rs717620位点基因型及等位基因分布频率比较〔n(%)〕Table 7 Comparison of genotypes and alleles frequencies of gene ABCC2 rs717620 of patient withⅣstage between the two groups

3 讨论

多药耐药相关蛋白亚家族中的ABCC2主要分布于肝细胞的管腔(顶)膜和肾近端小管细胞的管腔膜侧，还有少部分位于肠道、胆囊上皮细胞、胚胎及血－脑脊液屏障的内皮细胞等极性细胞的顶膜［2］。ABCC2在药物吸收、分布和排泄过程中具有非常重要的作用，通过其底物激活三磷酸腺苷酶水解ATP获得能量，以主动转运的形式将底物从细胞内泵出而转运物质。ABCC2基因存在遗传变异，其多态性同样可影响编码蛋白的表达和功能。当基因突变导致ABCC2发生氨基酸替换(lys325Met，Arg586Leu)时，这一作用减弱，细胞对铂类药物敏感性增强。该基因还可能通过促进GSH结合的铂类药物排出细胞外而增强肿瘤细胞对铂类药物的耐药性。同时其与长春新碱、足叶乙甙、阿霉素、表阿霉素等耐药亦有关。国外有研究报道，ABCC2基因不同位点的突变可使淋巴瘤及急性淋巴细胞白血病患者对甲氨喋呤化疗效果产生影响［3－4］。

此外，Wada［5］研究发现，ABCC2基因某些位点的突变存在种族差异，截至目前为止，关于ABCC2基因突变位点的研究仅涉及日本人、高加索人和极少部分中

国人，关于维吾尔族人群该基因突变位点的基因分布频率报道罕见。新疆作为少数民族聚居地区，地域辽阔，占据中国近1/6国土面积，其中维吾尔族人约占新疆总人口的45%以上。本研究发挥地域优势首次对比分析新疆地区维吾尔族、汉族晚期NSCLC患者ABCC2基因rs717620、rs2273697和rs3740066位点基因型及等位基因分布频率的差异。本研究结果显示，两组患者年龄、性别、病理类型、TNM分期及吸烟率无明显差异。基因分型清晰，符合Hardy－Weinberg遗传平衡，结果较可靠。两组患者ABCC2基因rs2273697、rs3740066位点基因型和等位基因分布频率无明显差异，ABCC2基因rs717620位点基因型及等位基因分布频率有差异。因此，针对该位点将两组患者进行亚组分析，结果显示腺癌亚组中ABCC2基因rs717620位点基因型及等位基因分布频率有差异，汉族晚期NSCLC患者ABCC2基因rs717620位点T等位基因分布频率高于维吾尔族晚期NSCLC患者，而鳞癌亚组未见此差异。在TNM分期的亚组分析中发现，汉族ⅢB和Ⅳ期NSCLC患者ABCC2基因rs717620位点基因突变率均高于维吾尔族患者。表明不同遗传异质性可导致不同人群、不同民族存在基因多态性差异，但研究地区不同、样本选择不同、样本量不同及实验方法不同同样可引起基因多态性分布差异，这种现象的存在可能导致不同种族之间药物处置及反应不同。

已有研究表明，维吾尔族晚期NSCLC患者的表皮生长因子受体(EGFR)突变率较低，与高加索人的肺癌突变率(7%～17%)相似［6］，因此使用EGFR－TKI靶向治疗的患者数量有限，大部分患者还需行铂二联标准方案化疗。在临床观察中发现，维吾尔族晚期NSCLC患者对肺癌化疗效果低于汉族晚期NSCLC患者，但缺乏进一步的临床数据及资料证明引起该种差异的原因。本研究结果显示，汉族晚期NSCLC患者ABCC2基因rs717620位点的突变率为27.6%，高于维吾尔族晚期NSCLC患者的11.8%，此位点突变率的高低是否影响汉族与维吾尔族晚期NSCLC患者对含铂类联合化疗的临床疗效还需要进行深入研究。国内外已有多项研究证实，ABCC2基因rs717620位点突变能提高含铂化疗药物治疗晚期NSCLC患者的疗效及延长其PFS［7－9］。但2012年Han等［10］研究发现，ABCC2基因C24T纯合子NSCLC患者接受铂类药物治疗的有效率较高〔OR (95%CI)=1.84(1.05，3.23)，P=0.032〕，与上述研究结果相互矛盾。这种差异可能与人群中复杂疾病遗传异质性、化疗方案不同及研究样本量大小有关。

本研究初步探讨了新疆地区维吾尔族、汉族晚期NSCLC患者ABCC2基因多态性差异，结果表明两民族NSCLC患者ABCC2基因rs717620位点基因多态性存在差异，而是否由该种差异导致汉族晚期NSCLC患者较维吾尔族晚期NSCLC患者对含铂化疗方案较敏感还有待进一步研究证实，同时后续研究将继续扩大样本量确认该位点基因多态性在维吾尔族和汉族晚期NSCLC患者中的差异。

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Differences of Genetic Polymorphisms of Gene ABCC2 between Uygur and Han Patients with Advanced Non－small Cell Lung Cancer in Xinjiang

HAN Zhi－gang，TAO Jie，WANG Qiang，et al．
The First Department of Respiratory Medicine，Tumor Hospital Affiliated to Xinjiang Medical University，Urumqi 830011，China

ObjectiveTo investigate the differences of genetic polymorphisms of gene ABCC2 between Uygur and Han patients with advanced non－small cell lung cancer(NSCLC)in Xinjiang.MethodsFrom March 2013 to August 2014，a total of 226 patients with advanced NSCLC were selected in the First Department of Respiratory Medicine，Tumor Hospital Affiliated to Xinjiang Medical University，and they were divided into groups A(Uygur nationality，n=110)and B(Han nationality，n=116)according to the nationalities.PCR－RFLP was used to detect the genetic polymorphisms of gene ABCC2，including rs717620，rs2273697 and rs3740066.ResultsThere were statistically significant differences of genotypes and allelic frequencies of rs717620 between the two groups(P＜0.05)，but no statistically significant differences of genotypes or allelic frequencies of rs2273697 or rs3740066 was found between the two groups(P＞0.05).There were statistically significant differences of genotypes and allelic frequencies of rs717620 of patients with adenocarcinoma between the two groups(P＜0.05)，but no statistically significant differences of genotypes or allelic frequencies of rs2273697 or rs3740066 of patients with squamous carcinoma was found between the two groups(P＞0.05).There were statistically significant differences of genotypes and allelic frequencies of rs717620 of patients withⅢB，Ⅳstage between the two groups(P＜0.05).ConclusionGenetic polymorphisms of gene ABCC2 rs717620 is different between Uygur and Han patients with advanced NSCLC in Xinjiang，but no obvious differences is found of genetic polymorphisms of gene ABCC2 rs2273697 or rs3740066.

Carcinoma，non－small－cell lung;ABCC2;Genetic polymorphisms;Uygur nationality; Han nationality

2基因引物序列 Table 2

基因正义链F反义链R ATAATTCCTGTTCCACTTTC 3' rs22736975'GCTGACACCAAAGGATAAATAGGAG 3'5'ACATCAGGTTCACTGTTTCTCCCA 3' rs37400665'GCGGTCCCAAAAGGGTCAGTCACCTACCTTCTCCATGCTATC 3'5'GCGGTCCCAAAAGGGTCAGTG rs7176205'GCGGTCCCAAAAGGGTCAGTCCTGGACTGCGTCTGGATC 3'5'GCGGTCCCAAAAGGGTCAGTGGTAG TTTAACAACTACCAAGTGCGG 3'

R 730.26

A

10.3969/j.issn.1008－5971.2015.03.011

2014－11－16;

2015－03－08)

(本文编辑:谢武英)

新疆维吾尔自治区自然科学基金(2013211A074)

830011新疆乌鲁木齐市，新疆医科大学附属肿瘤医院肺内一科

单莉，830011新疆乌鲁木齐市，新疆医科大学附属肿瘤医院肺内一科;E－mail:1378213986@qq.com