铜绿假单胞菌次生代谢产物的研究进展

（湖南农业大学植物保护学院，湖南长沙410128）

研究表明，微生物的生物多样性远比用传统方法估计的要广，但由于受分离培养技术的局限，目前可培养的微生物仅占自然界存在的0.1%～1%，因此，自然界中有数以百万计的微生物物种等待人们认识、挖掘和利用［1］。自从微生物中提取青霉素以来，人们已经从微生物代谢产物中提取出大量的生物活性物质，其中铜绿假单胞菌（Pseudomonasaeruginosa，PA）次生代谢产物日益受到人们的关注。

铜绿假单胞菌在自然界分布广泛，为土壤中存在的最常见的细菌之一。铜绿假单胞菌可产生多种活性物质，在医药、卫生方面的研究报道最多，其次在防治植物病害方面，可对多种植物病原真菌和细菌具有抑制作用。

作者对铜绿假单胞菌次生代谢产物进行综述，探讨存在的问题及未来的发展方向，旨在为铜绿假单胞菌次生代谢产物的科学研究提供参考。

1 次生代谢产物的种类

铜绿假单胞菌的次生代谢产物有很多种，如：生长素、铁载体、抗生素、酶、糖类等。Bano等［2］研究表明，铜绿假单胞菌可产生IAA 和铁载体。Ren等［3］进一步证实了铜绿假单胞菌能够产生铁载体。Tambong等［4］、葛宜和等［5］及Wang等［6］研究表明，铜绿假单胞菌能够产生吩嗪－1－羧酸或吩嗪－1－甲酰胺类抗生素。Gupta等［7］证实，铜绿假单胞菌能够产生酶类化合物胞外几丁质酶，可用于除菌和防治癌细胞转移。Lisa等［8］研究表明，铜绿假单胞菌可产生酸性磷酸酶，在医学上用于诊断前列腺癌。Peng 等［9］和Sharon 等［10］研究表明，铜绿假单胞菌产生的次生代谢产物中有脂肪酶，可催化一些酯类或不溶于水的物质，常用于工业酶制剂。另外，铜绿假单胞菌还能产生其它多种类型的酶，如蛋白酶、脱氢酶等。Illakkiam 等［11］研究认为，铜绿假单胞菌能够产生抗真菌化合物3，4－dihydroxyn－methyl－4－（4－oxochroman－2－yl）丁酰胺。Hay 等［12］指出，铜绿假单胞菌能够产生胞外多糖。Samadi等［13］和Al－Araji等［14］研究表明，铜绿假单胞菌能够产生鼠李糖脂表面活性剂。由此可见，铜绿假单胞菌产生的次生代谢产物种类繁多，这为解决我国植物病害防治、医药及卫生中存在的生长素少、催化剂缺乏等问题提供了材料来源。

2 次生代谢产物的提取方法

由于微生物产生的次生代谢产物必须经过提取、分离和纯化才能获得，其中，提取效率的高低对分离纯化获得纯品具有十分重要的影响。目前，从微生物次生代谢产物中提取活性物质的方法有很多种，如：溶剂法、渗漉法、蒸煮法、沉淀法、过滤法、离心法、电泳法等。不同的提取方法可得到不同的次生代谢产物。Qi等［15］采用氯仿从铜绿假单胞菌发酵液中提取获得了次生代谢产物，并分析了其活性成分。Sharon等［10］通过硫酸铵沉淀和连续的羟基磷灰石柱层析获得次生代谢产物。Jellouli等［16］采用丙酮沉淀、Sephadex G－75凝胶过滤盒超滤，然后使用10kPa的防渗膜，获得了所需的次生代谢产物。Mountassif等［17］使用硫酸铵分馏和蓝琼脂糖凝胶电泳－色谱法提取次生代谢产物。Sharma等［18］将无菌体的培养液冻干，再用QSepharose柱层析，然后通过不同盐梯度流量吸收次生代谢产物。

3 次生代谢产物的合成方法

由于微生物产生的次生代谢产物的量较少，仅依靠微生物自然生长很难满足实际生产的需要。目前，常常采用改善发酵条件或工艺，达到提高发酵效率、获取发酵产物的目的。研究表明，在最佳发酵条件的基础上，通过合成方法可进一步提高发酵效率。现在，微生物次生代谢产物的合成方法主要有2种，即生物合成法和化学合成法。生物合成法，就是通过改造目标微生物的基因，调控次生代谢产物的量，从而达到提高效率的目的。目前主要采用生物合成法合成铜绿假单胞菌次生代谢产物。张圆等［19］研究认为，转录调控因子Pip 对铜绿假单胞菌吩嗪合成代谢具有促进作用，提高了次生代谢产物的量。然而，国内外对微生物次生代谢产物化学合成的研究成果相对较少，这可能跟微生物次生代谢产物的成分复杂有关，尤其是针对铜绿假单胞菌次生代谢产物的化学合成研究鲜见报道，有待进一步研究。

4 次生代谢产物的作用机制

一般来讲，微生物次生代谢产物的作用机制主要包括破坏酶活性、破坏细胞壁、损害DNA 活性、减少蛋白质的量等方式。目前，在医疗、卫生方面，铜绿假单胞菌次生代谢产物的作用机制十分复杂，主要有粘附素，如胞外粘膜；产生破坏细胞的胞外产物，如：荧光色素、蛋白酶、磷脂酶等；产生β－内酰胺酶；产生耐药质粒，阻止药物到达靶标等。有时是几种作用机制混杂在一起［20］。

在防治植物病害方面，国内外有很多关于铜绿假单胞菌防治植物病原真菌病害和细菌病害的报道，但有关其次生代谢产物作用机制的研究报道较少，有待进一步研究，为开发安全、环保、高效的生物农药提供理论依据。

5 次生代谢产物的用途

铜绿假单胞菌产生的次生代谢产物种类多样，其用途也十分广泛。任小平等［21］报道铜绿假单胞菌粗提液对水稻纹枯病菌具有一定的抑制作用。Viji等［22］通过盆栽和大田试验发现，预先施用铜绿假单胞菌能很好地防治黑麦草灰斑病。Dutta等［23］研究发现，铜绿假单胞菌能诱导大豆系统抗病性，预防镰刀菌的侵染。余超等［24］从香蕉植株体内分离的铜绿假单胞菌内生生防菌FJAT－346－PA 可对香蕉枯萎病具有较好的防治效果，盆栽防效和田间防效分别为83.67% 和82.00%。石晶盈等［25］从番木瓜果皮中分离筛选到一株具有拮抗活性的铜绿假单胞菌MGP3，对番木瓜炭疽病和疫霉病的防治效果分别达到50%和71%。郝晓娟等［26］研究发现，铜绿假单胞菌FJAT－346对香蕉、番茄、西瓜、甜瓜枯萎病菌、番茄灰霉病菌、油菜菌核病菌等均有良好的离体拮抗效果。铜绿假单胞菌次生代谢产物几丁质酶可以用于防治油菜菌核病［7］。吩嗪－1－羧酸（phenazine－1－carboxylic acid，PCA）和藤黄绿脓菌素（pyoluteorin，Plt）对多种农作物病害的病原真菌、细菌具有显著的抑制或杀灭作用［27］。突变酰胺酶由于含有酰胺酶蛋白，可用于单克隆抗体特异性检测和一些致病细菌菌株的临床判断［28］。角蛋白酶具有降解作用，能够降解一些比较顽强的蛋白质，在化妆品和皮革制造业中都发挥着很大的作用［18］。Johnson等［29］证实羧酸酯酶在农药解毒方面有一定的作用。利用有机溶剂提取的蛋白质还可以用作生物催化剂［30］。Isono等［31］证实三酰基甘油酰基水解酶能够催化在油－水界面长链甘油三酯的水解。Pabai等［32］证实三酰基甘油酰基水解酶能够参与酯化和酯交换反应，可用于食品添加剂、洗涤剂、临床试剂、油脂化学品和清洁产业［8］。表面活性剂鼠李糖脂还可用于石油和制药行业［13］。

6 问题与展望

铜绿假单胞菌次生代谢产物在农业、医药和化妆品行业都有十分广阔的应用前景，但是，对其次生代谢产物的研究不深入，也不彻底，仍存在不少问题。

（1）成分解析困难。由于铜绿假单胞菌的次生代谢产物种类较多，依靠现有的技术水平，还不能把所有的代谢产物全部分析出来，今后还需明确其成分和结构。况且，利用现在的分离纯化技术获得较纯的次生代谢产物还很困难，尽管已有研究结果显示，采用HSCCC技术可以提高分离效率和纯度，但还有待验证。

（2）代谢物产量低。仅依靠发酵提高次生代谢产物的量十分有限，为获得大量的次生代谢产物，选择最佳提取方法十分重要，但这不仅涉及发酵条件，还涉及到提取方法的不同，由于被提取的次生代谢产物的性质不同，获取次生代谢产物就需要考虑多种因素，既要保证获取最多的次生代谢产物，又要使其不失活。而最新采用生物合成提高次生代谢产物的产量，也有待在生产中进一步验证；另外，采用化学合成方法合成次生代谢产物的难度较大，不仅需要投入大量的人力、物力和财力，而且还要耗费时间和精力。

（3）污染环境。目前多采用有机溶剂提取次生代谢产物，但是有机溶剂不仅污染环境，而且造成不少浪费。最新的研究结果表明，采用超临界萃取技术，可以解决有机溶剂污染和浪费问题，提高提取效率，有望在今后推广和应用。

（4）商品研发困难。以铜绿假单胞菌次生代谢产物为先导化合物开发的产品还比较少，而且防治效果不稳定，需要通过结构改造或化学修饰克服弊端，增强其稳定性。

随着人们生活水平的提高和安全意识的增强，化学农药的应用越来越受到限制，甚至停用，因此，探索能替代化学农药的新药剂迫在眉睫。近年来，从拮抗微生物次生代谢物中筛选生物活性物质成为研究热点，研究者相继明确了活性物质的结构，研发出具有推广价值的生物农药。由于此类型农药具有高效、低毒、安全、不易产生抗药性等优势，将来替代化学农药成为一种必然趋势。铜绿假单胞菌作为一种具有抑菌活性的微生物，可产生多种抑菌活性物质，如：绿脓菌素、吩嗪－1－羧酸、吩嗪－1－甲酰胺等，但这些天然化合物多数不易溶于水，在应用时需要添加有机溶剂，给环境带来了二次污染，增加了推广和应用的难度。自利用生物农药防治植物病害以来，研究者一直致力于降低环境污染，提高防治效果，尤其是减轻二次污染，因此，如何通过结构改造或添加水溶性助剂提高天然活性物质的水溶性，将是未来生防专家研究的重要课题，也是将来研究的重要方向。

总之，由于铜绿假单胞菌的次生代谢产物种类多，应用范围广，对于存在的问题还需要在科学实践中不断探索，以尽早满足科学要求和社会需要。

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