腺苷酸活化蛋白激酶在哺乳动物卵巢发育中的调控作用及其机制

摘 要：腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）信号通路作为调节细胞能量代谢状态的中心环节，是调控哺乳动物繁殖性能的关键因子。已有研究表明，AMPK在哺乳动物卵巢发育中主要通过介导葡萄糖、胰岛素样生长因子－1（IGF⁃1）、促卵泡素（FSH）、脂联素等发挥功能。本文就AMPK在哺乳动物卵巢发育中的调控作用及其机制进行综述，旨在引起人们对AMPK调控卵巢发育的关注，并为卵巢疾病的治疗提供一定参考。

文献标识码：A

文章编号：1006⁃267X（2015）10⁃3006⁃06

doi：10．3969／j．issn．1006⁃267x．2015．10．003

收稿日期：2015－04－28

基金项目：四川省教育厅重点项目（13ZA0259）；四川农业大学引进人才科研启动项目；川猪遗传改良与安全生产教育部创新团队（IRT13083）

作者简介：许蒙蒙（1988—），女，河南安阳人，硕士研究生，从事动物营养与饲料科学研究。E⁃mail：xumengmeng2013＠126．com

∗通信作者：徐盛玉，副研究员，硕士生导师，E⁃mail：shengyuxu＠sicau．edu．cn

繁殖性能的高低是雌性动物生产力的重要体现。卵巢在雌性动物繁殖功能发挥中起着不可替代的作用，其中卵泡、卵母细胞、颗粒细胞作为卵巢的主要组成成分，对卵巢发育起着至关重要的作用 ［1］。若卵巢发育发生异常，将会导致女性出现闭经、月经紊乱、生育力下降等繁殖疾病 ［2］，在母猪上则表现为排卵率、发情率、产仔数均降低 ［3］。研究表明，饲粮能量限制引起血清代谢底物变化，促性腺激素释放激素（GnRH）神经元感知后，导致促黄体素（luteinizing hormone，LH）脉冲受限，从而降低卵母细胞成熟率 ［4］。Zhou等 ［5］对后备母猪饲喂能量水平为112．5%NRC推荐水平饲粮，第2情期第19天屠宰，发现大于4 mm的卵泡数较低能量（能量水平为87．5%NRC推荐水平饲粮）饲喂组多。给泌乳期母猪饲喂净能为44 MJ／d的饲粮，下一情期的排卵率高于净能为33 MJ／d饲粮饲喂组 ［6］。可见，能量对卵巢发育的影响不仅表现在其饲喂期间，而且对下一生产周期也起着至关重要的调控作用。AMPK作为一个调节能量状态的异源三聚体蛋白激酶，包括催化亚基α（PRKAA1、PRKAA2）和调节亚基β（PRK⁃AB1、PRKAB2）、γ（PRKAG1、PRKAG2、PRKAG3） ［7］。细胞能量状态出现异常或处于应激、缺氧状态将会导致一磷腺苷酸（AMP）含量增加，促使AMP与AMPK的调节亚基γ结合，产生变构效应，最终AMPK被激活 ［8］。研究表明，不同物种（猪、羊、牛、兔）卵巢均有AMPK存在 ［9］。多种因素［葡萄糖、胰岛素样生长因子－1（insulin⁃like growth factor⁃1，IGF⁃1）、促卵泡素（follicle stimula⁃ting hormone，FSH）、脂联素］可通过激活或抑制AMPK调节能量平衡，进而调控卵巢发育。

1 卵巢的发育

卵巢是决定雌性动物繁殖力的动态发育器官，其卵母细胞、卵泡、颗粒细胞经历着不同发育阶段的多样转化。原始生殖细胞迁移至生殖脊形成卵原细胞，历经初级卵母细胞、次级卵母细胞、成熟卵母细胞等复杂变化为雌性哺乳动物排卵提供必要条件。卵泡是为卵母细胞生存、发育提供必要环境的组织，随着卵母细胞的发育也经历了原始卵泡、初级卵泡、窦前卵泡、窦状卵泡和成熟卵泡的复杂过程。颗粒细胞作为为卵母细胞提供代谢底物的关键组织，在发挥作用的过程中其形态和层数也发生着变化，单层扁平的颗粒细胞随着其发育的进行变为立方形，随后层数逐渐增加直至最终的多层。

2 AMPK对卵巢发育的影响

卵巢内外的许多因子对其复杂发育过程进行调控。而在卵巢发育为具有繁殖性能器官的过程中，需要能量的产生和消耗，AMPK作为调节细胞能量代谢状态的中心物质，是调控哺乳动物卵巢发育的关键因子。前人研究发现，分离获得20～23日龄的小鼠卵母细胞，用二丁酰环腺苷酸、AMPK失活剂（dead kinase，D139A）、AMPK激活剂（5⁃aminoimidazole⁃4⁃carboxamide1⁃β⁃D⁃ribofurano⁃side，AICAR）进行处理，结果表明，AICAR组生发泡破裂（germinal vesicle breakdown，GVBD）率显著高于其他组（高于其他组23%～71%），二丁酰环腺苷酸组GVBD率也显著高于其他2组 ［10］。对猪卵母细胞进行脂联素处理，结果发现AMPK磷酸化水平升高，未成熟卵母细胞数量显著降低（12．90 vs．23．04） ［11］。以上研究表明，AMPK可提高卵母细胞减数分裂的恢复能力和卵母细胞的成熟率。而另有证据表明AMPK抑制卵泡发育。Gallet等 ［12］探讨了AMPK磷酸化水平对羊卵泡发育的影响，以相同剂量［10 mmol／（L·h）］的生理盐水、葡萄糖处理卵泡，发现生理盐水组AMPK磷酸化水平为68．3%，葡萄糖组AMPK磷酸化水平为45．1%，而低磷酸化水平组卵泡总数（36．40± 5．48 vs．16．70±2．60）和小卵泡数（28．20±6．40 vs．10．00±2．24）显著高于高磷酸化水平组，同时发现2组之间的卵泡凋亡也有差异（4．40±0．51 vs．3．70±0．92）。对牛颗粒细胞进行AMPK激活剂——二甲双胍（metformin）处理以提高AMPK磷酸化水平，利用3H－胸腺嘧啶核苷掺入法测定颗粒细胞增殖状况，发现AMPK抑制了颗粒细胞增殖（100%vs．80%） ［13］。

综上，AMPK对卵巢的发育起着至关重要的作用，活化的AMPK对卵母细胞减数分裂和成熟起着重要的促进作用，但是对卵泡、颗粒细胞的发育却有一定的负面影响。

3 AMPK对卵巢发育的调节途径

3．1 介导葡萄糖调控卵巢发育

哺乳动物卵巢中，不同类型的代谢应激、药物等均可改变AMP、二磷酸腺苷（ADP）与三磷酸腺苷（ATP）的比值，导致AMPK被激活。近期研究发现，葡萄糖作为一种营养物质，调控卵母细胞线粒体结构。葡萄糖浓度过高，导致ATP水平在排卵期显著降低 ［14］，激活AMPK，影响排卵率，即葡萄糖为典型的影响AMPK活性，抑制分解代谢产生ATP，进而调控卵巢发育途径的关键因素。Ratchford等 ［15］考察了高浓度葡萄糖对鼠卵母细胞发育能力的影响，结果发现糖尿病鼠卵母细胞中AMP与ATP比值增加，促进了卵母细胞减数分裂恢复。这可能是由于高糖状态下细胞受到应激，ATP消耗增加，激活AMPK所致。

对经典的人卵巢癌上皮细胞系SKOV3、TOV21G、OVCA429进行葡萄糖饥饿、2－脱氧－D－葡萄糖（2⁃deoxy⁃D⁃glucose，2DG）处理，结果显示，葡萄糖饥饿组、2DG组AMPK磷酸化水平上调，随后对3种细胞系分别进行AMPK激活剂AIC⁃AR、二甲双胍处理，发现AMPK磷酸化水平进一步上调 ［16］，进而诱导卵巢癌细胞死亡。这暗示着低糖状态下，为了满足机体自身生长需要，糖分解过程受阻，导致AMPK磷酸化水平改变，促进机体分解代谢，进而影响卵巢发育。

值得注意的是，长期膳食高浓度葡萄糖产生大量乳酸盐，导致卵巢生理功能紊乱，产生卵巢癌。Priebe等 ［16］探讨卵巢癌细胞治疗方法时发现葡萄糖饥饿激活AMPK，进而增加了卵巢癌细胞的死亡。这就提示治疗卵巢癌可以进行AMPK激活剂治疗，使依赖葡萄糖生长和存活的癌细胞凋亡。

以上研究表明短期膳食高浓度葡萄糖可改变ATP含量，进而激活AMPK，促进卵母细胞发育。但是长期的高浓度葡萄糖却可导致卵巢疾病，同时葡萄糖缺乏也可提高AMPK磷酸化水平，影响卵巢发育。尽管葡萄糖浓度不论高低均会激活AMPK，但是高浓度葡萄糖介导AMPK活化对卵母细胞发育、低浓度葡萄糖介导AMPK活化对癌细胞增殖抑制均起正调控效应，其具体的机制仍需进一步探究。

3．2 介导IGF⁃1调控卵巢发育

IGF⁃1对哺乳动物卵巢细胞类固醇激素分泌和增殖起着关键作用 ［17］。AMPK信号通路作为调节细胞能量代谢状态的中心环节，可增加卵巢对IGF⁃1的敏感性 ［18］。Tosca等 ［19］研究发现，在牛颗粒细胞中，二甲双胍可通过激活AMPK降低类固醇的分泌，同时还可治疗与胰岛素抵抗密切相关的多囊卵巢综合征（polycystic ovary syndrome，PCOS）。这主要是由于胰岛素可刺激IGF⁃1的合成，进而激活哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammali⁃an target of rapamycin，mTOR），进行合成代谢，消耗ATP，从而抑制AMPK活化，即二甲双胍添加激活AMPK可达到治疗繁殖疾病的目的。卵巢颗粒细胞表达IGF⁃1受体（IGF⁃1R），适宜浓度的IGF⁃1可通过与其受体结合，抑制AMPK活化，上调3β－羟类固醇脱氢酶（3βHSD）、类固醇激素合成急性调节蛋白（steroidogenic acute regulatory protein，StAR）、P450scc的表达以及细胞外调节蛋白激酶（mitogen⁃activated protein kinase／extracellular⁃regu⁃lated kinase，ERK）磷酸化，从而提高卵巢细胞孕酮（P）和雌二醇（E2）的分泌 ［20］。与此观点一致的研究发现IGF⁃1处理的颗粒细胞（分别处理1、5 min），AMPK磷酸化水平降低（分别降低10%、30%），增加P的分泌 ［21］，影响卵巢发育。AMPK介导IGF⁃1调控卵巢发育主要是通过调控IGF⁃1R信号通路的磷酸化。Reverchon等 ［22］发现10和100 ng／mL脂肪细胞因子趋化素（chemerin）处理人的卵巢颗粒细胞显著降低了P和E2分泌，同时IGF⁃1R表达上调，AMPK磷酸化水平增加；而缺乏IGF⁃1组进行趋化素处理，P和E2分泌无变化，但是2种处理均抑制了细胞的增殖。这就说明趋化素活化AMPK导致细胞增殖受阻需要IGF⁃1作用。AMPK介导IGF⁃1异常时会导致卵巢发生疾病。与代谢异常密切相关的高胰岛素水平与AMPK有密切联系。妊娠前的高胰岛素水平，将导致卵母细胞发育能力降低及卵泡液内环境紊乱，可能是通过对胰岛素、IGF⁃1敏感的葡萄糖转运蛋白4（glucose transporters 4，SLC2A4）调节葡萄糖代谢，使卵巢处于较高浓度的葡萄糖下，进而影响AMPK的磷酸化，导致卵巢处于疾病状态。

总之，AMPK介导IGF⁃1为卵巢细胞类固醇的分泌和细胞的增殖提供条件，在此过程中AMPK可调节IGF⁃1R信号通路调控卵巢发育，同时AMPK介导IGF⁃1异常将会导致卵巢疾病。因此，卵巢中AMPK介导IGF⁃1受到机体复杂协调的调控。

3．3 介导FSH调控卵巢发育

FSH可通过复杂的信号通路增加颗粒细胞的有丝分裂，对卵泡正常生长发育起着关键作用。近期有研究表明，FSH刺激颗粒细胞增殖主要是通过抑制AMPK的活化，暗示AMPK是调节卵巢细胞增殖功能的关键信号 ［23］。Kayampilly等 ［23］体外培养鼠的颗粒细胞时发现，FSH增加有丝分裂数目，主要是通过AMPK依赖途径降低细胞周期抑制蛋白P27（cell cycle inhibitor protein，p27kip）、增加细胞周期蛋白D2（cyclin D2）表达进行调控。若雌性动物机体处于高雄激素状态下，雄激素代谢产物5α－双氢睾酮（5α⁃dihydrotestos⁃terone，DHT）可提高AMPK磷酸化水平，而且抑制ERK磷酸化水平，导致FSH对AMPK的抑制作用失效，使颗粒细胞增殖受到抑制，同时该学者还发现ERK可能是AMPK下游因子 ［24］。此外，也有研究报道AMPK磷酸化可在不同程度上影响mTOR，而mTOR在介导FSH影响哺乳动物细胞增殖方面起着重要作用 ［25］，这说明FSH与AMPK作用，除了通过ERK调节细胞增殖外，还可能通过其他途径进行调控，总之，FSH可抑制AMPK磷酸化水平，在卵巢颗粒细胞增殖方面起着至关重要的作用，但在一定条件下FSH对AMPK的抑制作用无应答。因此，关于AMPK是如何与FSH相互协调促进颗粒细胞增殖的具体机制还有待进一步的研究。

3．4 介导脂联素调控卵巢发育

脂联素是脂肪细胞分泌的可调节卵巢发育的一种重要的细胞因子 ［26］，研究表明不同哺乳动物（猪、羊、牛、兔、人）卵巢均有脂联素表达，但不同物种其存在部位有差异 ［9］。卵巢细胞上具有脂联素受体（AdipoR）1和AdipoR2 ［27］。脂联素通过与其受体结合调节AMPK磷酸化影响卵巢颗粒细胞增殖和卵母细胞成熟。

Chabrolle等 ［28］通过对鼠颗粒细胞添加5 mg／mL重组脂联素，发现3βHSD、p450scc和StAR等与类固醇合成相关的关键酶以及类固醇的表达与对照组无差异，但P、E 2的含量和AMPK磷酸化水平提高，同时对颗粒细胞数目有影响，这可能是由于脂联素通过改变AMPK磷酸化水平，导致卵巢类固醇合成过程中关键酶的敏感性增强。也有观点表明，脂联素可通过调节AMPK磷酸化，增加IGF⁃1诱导IGF⁃1Rβ亚基酪氨酸磷酸化，促进P、E2的生成，即脂联素在颗粒细胞中可增加IGF⁃1诱导类固醇的分泌。进行重组脂联素处理，可使GnRH受体转录水平降低，进一步导致LH分泌降低，同时发现AMPK磷酸化水平上调，即脂联素可通过调节AMPK磷酸化水平，抑制LH释放调节卵巢发育 ［29］。

Ledoux等 ［13］体外培养猪卵泡，浓度为10～25 g／mL的脂联素增加AMPK磷酸化，进而调节类固醇合成中关键酶基因的表达，而且AMPK磷酸化水平与CYP19 mRNA表达量呈现相反趋势，可能是由于脂联素调节卵泡发育的不仅仅是通过AMPK信号途径，或者由于培养基中没有添加葡萄糖致使卵泡发育过程中糖分解过程受阻，基因表达出现异常。另外，体外受精试验发现，脂联素介导AMPK磷酸化，对卵母细胞成熟起重要作用 ［11］。10 μg／mL脂联素提高AMPK磷酸化，增加猪大卵泡中卵母细胞的成熟率，但是奇怪的是脂联素对小卵泡中卵母细胞的减数分裂没有影响，具体机制仍需进一步探究。总之，AMPK介导脂联素对卵母细胞成熟起着不可忽视的作用。

综上，AMPK介导脂联素影响卵巢发育相关基因的表达，调控卵母细胞的成熟和颗粒细胞的增殖。同时脂联素调节AMPK磷酸化后，可影响IGF⁃1R、LH的分泌，从而对卵巢发育产生一定影响，但其具体的调控机制还有待进一步研究。这一问题的研究将对阐明哺乳动物卵巢发育的分子机制具有重要的理论意义。

4 小 结

细胞能量代谢中心物质AMPK作为调控卵巢发育的关键因子，在卵巢发育过程中起着不可忽视的作用。葡萄糖、脂联素可促进AMPK磷酸化，而IGF⁃1、FSH则抑制AMPK磷酸化。磷酸化的AMPK促进卵母细胞发育，但对卵泡、颗粒细胞发育起负调控作用。但是，目前以动物为模型研究体内AMPK的调控作用，主要集中于下丘脑中AMPK对采食量和情期启动的影响等方面，而体内卵巢上表达的AMPK如何影响卵巢发育的相关内容未见报道，值得探究。同时，目前AMPK调控卵巢细胞的分子机制研究较少，有关AMPK介导葡萄糖、IGF⁃1、FSH和脂联素调控卵巢类固醇的分泌以及细胞增殖和凋亡的具体调控机制仍需进一步探究。特别是高、低浓度葡萄糖均可激活AMPK的具体分子机制以及FSH在一定条件下抑制AMPK应答失效的分子机制需更深入的探究。