高效液相色谱法测定奥扎格雷钠脂质体的包封率

柳 青，刘丽凤，孙昌友，李慧芳

高效液相色谱法测定奥扎格雷钠脂质体的包封率

柳 青1，刘丽凤1，孙昌友1，李慧芳2

目的 建立高效液相色谱法(high performance liquid chromatography，HPLC)测定奥扎格雷钠脂质体包封率的检测技术。方法 采用HPLC，以C18色谱柱分离，以0.05 mol/L磷酸二氢钾溶液(pH=7.0)-甲醇-乙腈(80∶15∶5)为流动相，检测波长为274 nm测定。结果 奥扎格雷在10～100 μg/ml浓度范围内线性关系良好，r=0.9997。日内、日间RSD均小于0.5%，方法回收率为(100.2±0.42)%，样品的平均包封率为(94.89±0.44)%。结论 该测定方法简单，准确度高，灵敏度好，适合奥扎格雷钠脂质体的包封率测定。

奥扎格雷钠；脂质体；包封率；高效液相色谱

奥扎格雷钠(ozagrel hydroehloride)是一种特异性血栓素合成酶抑制药，能抑制血栓素A2(TXA2)的生成，具有抗血小板聚集和扩张血管的作用[1]。制剂有注射用奥扎格雷钠及奥扎格雷钠注射液，主要用于急性血栓性脑梗死和脑梗死所伴随的运动障碍，以及改善蛛网膜下腔出血手术后的脑血管痉挛收缩和并发脑缺血症状的治疗[2]。在国家药品标准中，注射用奥扎格雷钠及奥扎格雷钠注射液和冻干粉针的含量测定均采用紫外分光光度法[3]。文献[4-9]报道，奥扎格雷钠注射剂和奥扎格雷片的测定方法均为反相HPLC。笔者建立了HPLC法测定奥扎格雷及其脂质体包封率的检测技术，它方便简单，结果准确，能够满足实验需求。

1 仪器与试药

1.1 仪器 1200系列高效液相色谱系统(美国Agilent公司)，包括G1315B DAD检测器，G1311A四元泵，G1329A标准型自动进样器，G1316A柱温箱。

1.2 试药 奥扎格雷对照品(批号100557-201304，中国药品生物制品检定所，纯度>99.6%)；奥扎格雷钠脂质体(自制，批号为20110623，20 mg/ml)，乙腈、甲醇均为色谱纯(山东禹王实业有限公司)，磷酸二氢钾为分析纯，水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 色谱柱 Agilent C18柱(4.6 mm×150 mm，5 μm)；流动相0.05 mol/L磷酸二氢钾溶液(pH=7.0)-甲醇-乙腈(80∶15∶5)；柱温25 ℃；检测波长274 nm；流速1 ml/min；进样量20 μl。理论板数按奥扎格雷峰计不低于2000，奥扎格雷峰与其他相邻杂质峰之间的分离度符合要求(R≥1.5)，奥扎格雷峰的拖尾因子<1.5(图1)。

图1 奥扎格雷HPLC色谱图

2.2 线性试验 精密称取奥扎格雷对照品20 mg，置100 ml容量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，分别精密量取上述贮备液0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 ml置10 ml量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，精密量取20 μl注入色谱仪，记录色谱图。以奥扎格雷的浓度(μg/ml)为横坐标，以奥扎格雷的峰面积为纵坐标，其回归方程为：A=12.379C+6.3358，r=0.9998。结果表明，奥扎格雷在10～100 μg/ml范围内与峰面积呈现出良好的线性关系(图2)。

2.3 溶液稳定性试验 精密配制浓度为50 μg/ml的供试品溶液6份，于0、2、4、8 h分别进样测定，记录色谱图。试验结果表明，奥扎格雷峰面积RSD为0.3%，样品溶液在8 h之内稳定。

2.4 精密度试验 精密配制浓度为50 μg/ml的供试品溶液3份，平行进样，每份溶液重复进样6次，测定峰面积的RSD%为0.4%，方法的日内精密度符合试验要求。精密配制浓度为50 μg/ml的供试品溶液3份，平行进样，同一时间连续进样6 d，测定峰面积的RSD%为0.3%，方法的日间精密度符合试验要求。

2.5 回收率试验 精密量取奥扎格雷钠脂质体适量，加入适量四氢呋喃破乳后，加入甲醇制成一定浓度的溶液，加入等量的奥扎格雷对照品，按上述色谱条件进行加样回收率试验，其平均回收率为100.2%，RSD为0.42%(n=6)，见表1。

图2 奥扎格雷对照品溶液标准曲线

表1 奥扎格雷钠脂质体检测结果

2.6 奥扎格雷脂质体包封率测定 精密量取奥扎格雷脂质体0.5 ml，上预先处理好的Sephadex-G50凝胶柱，用pH6.5的磷酸盐缓冲液以0.8 ml/min速度洗脱，收集药物流出液70～80 ml，用甲醇定容至100 ml，取20 μl进样，计算溶液中奥扎格雷的含量(W游)；另取0.5 ml奥扎格雷脂质体18份，分别加入适量的甲醇、乙醇、水-异丙醇-乙醚(2∶2∶1)、乙醚、乙酸乙酯、四氢呋喃破乳，各做3份，用甲醇定容至100 ml，取20 μl进样，计算脂质体中药物的总量(W总)。计算包封率，包封率(%)=(1-W游/W总)×100%。结果显示：四氢呋喃效果最好，最终选用四氢呋喃作为破乳溶剂(表2)。

表2 奥扎格雷脂质体包封率检测结果 (n=3)

注：四氢呋喃与其他各组比较，P均<0.01

3 讨 论

笔者通过实验建立了奥扎格雷脂质体的包封率检测方法。该方法线性范围宽，精密度、准确度、回收率都满足要求，且操作简单、方法灵敏，能够准确检测奥扎格雷脂质体中奥扎格雷的包封率，为质量控制提供了可靠的方法。在色谱条件摸索过程中，对多种流动相体系进行筛选，确定以磷酸二氢钾-甲醇-乙腈体系为最佳，通过调整有机相比例，使主峰与相邻杂质峰得到了分离，最终确定以0.05 mol/L磷酸二氢钾溶液(pH=7.0)-甲醇-乙腈(80∶15∶5)为流动相，满足了实验需求。

对包封在脂质体中药物的测定，需加入一定量破膜溶剂以对磷脂双分子层进行破坏，让药物从载体中完全释放出来，从而保证测定结果的准确性，最终选用四氢呋喃作为破乳溶剂，能够达到很好的效果，是符合试验的破乳剂。

该方法与以往的检测方法比较，操作简单，精密度、准确度均能达到药典要求，且容易实施，为后期含量测定和制定质量标准提供有力的依据。

[1] 刘 洋. 奥扎格雷治疗脑血栓形成的临床研究[J]. 中国实用医药，2014，9(34): 142-144.

[2] 安小兰. 奥扎格雷治疗脑梗死临床疗效观察[J]. 医学理论与实践，2013，26(21): 2844-2845.

[3] WS1-(X-095)-2005Z，国家食品药品监督管理局国家药品标准[S].

[4] 张 勇，陈玉威，高桂花.内标法测定奥扎格雷钠颗粒的含量[J].实用药物与临床，2013，1(6): 517-519.

[5] 沈晓霞.HPLC法测定注射用奥扎格雷钠的含量[J].中国药师，2007，10(4): 348-350.

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[7] 朱 平，李 娜，王志敏.高效液相色谱法测定奥扎格雷钠注射液中有关物质[J].山西医科大学学报，2007，38(11): 1010-1012.

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(2014-11-15收稿 2015-03-06修回)

(责任编辑 武建虎)

Encapsulation efficiency of ozagrel hydroehloride liposome by HPLC

LIU Qing1，LIU Lifeng1, SUN Changyou1，and Li Huifang2.

1.Department of Pharmacy, Shanxi Provincial Corps Hospital, Chinese People’s Armed Police Forces, Taiyuan 030006, China；2.Department of Pharmacy, Shanxi Labor Medical School，Taiyuan 030012，China

Objective To establish a high performance liquid chromatography (HPLC) method for the encapsulation efficiency of ozagrel hydrochloride liposome. Methods The HPLC was used for determination. A C18 column was used with the mobile phase of 0.05 mol/L potassium dihydrogen phosphate solution (pH=7.0) - acetonitrile - methanol (80∶15∶5) at the detection wavelength of 274 nm. Results The calibration curve was linear in the concentration range of 10-100 μg/ml,r=0.9997. The inter- and intra- day RSD was less than 0.5 %. The method recoveries were (100.2±0.42) %. The average entrapment efficiency of tartrate indoquinoline liposome was (94.89±0.44)%. Conclusions This method is simple，accurate and can be used to determine the encapsulation efficiency of ozagrel hydroehloride in ozagrel hydrochloride liposome.

ozagrel hydroehloride; liposome; encapsulation efficiency；HPLC

柳 青，本科学历，副主任药师，E-mail：594924223@qq.com

1.030006 太原，武警山西总队医院药剂科；2.030012 太原，山西职工医学院药学系

孙昌友，E-mail:scy196410@163.com

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