药用植物种质资源超低温保存及遗传变异特性研究进展

王晗，雷秀娟，宋娟，尹红新，王英平

(中国农业科学院特产研究所，长春 130112)

1 前言

药用植物种质资源是中药产业发展的基础。我国虽然药用植物资源丰富，但由于收集与保存体系不完善，造成药用植物种质资源遗传多样性的丢失和缩减，给种质创新、育种工作带来很大困难。超低温保存与就地保存、迁地保存等传统方法相比，具有不受季节、土壤、气候等自然环境条件的影响，且遗传变异小、保存时间长等优点，因此，超低温保存被认为是种质资源长期保存最有效的方法，其遗传变异特性是最受关注的问题之一。

2 药用植物种质资源超低温保存研究

超低温保存是在-80℃及更低的温度下保存种质资源的一种方法，一般以液氮为冷源，使温度维持在-196℃，材料在此温度下生长几乎处于“停顿”状态，即所有细胞分裂和代谢活力都停止，避免种质资源在保存过程中可能造成遗传性状的退化和变异[1]。

2.1 材料的选择

研究表明，材料的抗冻性以及细胞的年龄、生理状态等因素对超低温保存的效果有较大的影响，因此，在超低温保存之前，材料的选择十分重要[2]。一般情况下，细胞质浓、无液泡、体积小的分生组织细胞的存活率高于含大液泡的成熟细胞；取生长后期或对数生长期的细胞培养物能得到最高的存活率[3]。目前，常用的超低温保存材料主要有植物幼嫩组织、组织培养物和植物器官3大类。

2.1.1植物幼嫩组织植物的一些幼嫩组织(如分生组织、茎尖、根尖等)细胞分裂能力强、分化程度高，有较高的超低温耐性，使其在低温保存条件下有较好的遗传稳定性，所以幼嫩组织是超低温保存的理想材料[4]。目前，已成功实现茎尖分生组织超低温保存的药用植物有高山红景天、地黄等[5，6]。芽的超低温保存也是保存种质资源的有效途径，Kuoksa等[7]冷冻保存了苏格兰松树的芽，其冻后存活率高达90%～100%。

2.1.2组织培养物愈伤组织和胚状体是植物组织培养中最常见的组织培养物，但愈伤组织在长期继代培养，尤其是在花药诱导培养过程中愈伤组织的染色体会发生变异，由单倍体变为2倍体，因此，对愈伤组织的保存显得尤为重要。目前，已成功实现愈伤组织超低温保存的药用植物有浙贝母、高山红景天、银杏等[8～10]。胚状体一般是由愈伤组织分化而来，目前，已成功实现胚状体超低温保存的药用植物有铁皮石斛等[11]。

2.1.3植物器官超低温保存的植物器官主要有花粉和种子两大类。花粉是植物种质的形式之一。由于花粉的生长寿命时间较短，遗传多样性丰富，所以花粉的保存对完善种质资源具有重要的意义。20世纪80年代以来，花粉超低温保存开始兴起。1979年，Akihama等[12]在日本果树实验站建立了花粉库，美国也相继建立了3个花粉超低温中心，进行花粉超低温保存并对保存机理进行了探讨。花粉超低温保存工作从最初的大田作物逐渐发展到经济作物。目前，已成功实现花粉超低温保存的药用植物有人参、西洋参、枸杞、浙贝母、商路等[13]。但花粉在超低温保存的最长时间、复苏后花粉生活力的变化情况还有待继续探究。

种子在形态后熟和生理后熟过程会进一步的脱水，使含水量大大降低，是目前超低温保存范围最广的植物材料，但是，自Sakai等[14]报道了关于超低温保存的研究开始至今，大多数都是农作物和蔬菜花卉种子的超低温保存研究[15]，很少看到药用植物种子超低温保存的研究。

2.2 材料预处理

为了使材料达到超低温保存所需要的生理特性，必须对材料进行预处理，其目的是为了提高处于分裂期细胞的数目，减少细胞内自由含水量，增强细胞抗寒力[16]。目前，针对材料的不同，预处理方法一般分为低温锻炼、继代培养和预培养。

2.2.1低温锻炼低温锻炼，又称冷驯化，是指在4℃左右低温处理一段时间，激活材料的保护机制，从而提高抗低温的能力。此外，经过低温锻炼，细胞发生保护性脱水，避免因细胞内大量结冰而引起死亡[2]。

2.2.2继代培养继代培养是指生长的材料隔一段时间进行转接继代。研究结果表明，继代培养可增加植物有丝分裂细胞数，处于该时期的细胞超低温保存后成活率较高[13，16，17]。

2.2.3预培养预培养是指在培养基中加入冷冻保护剂，如二甲基亚砜(DMSO)、蔗糖、葡萄糖、水解酪蛋白、山梨醇、脱落酸等。当培养基中加入这些冷冻保护剂后，可使细胞内、外形成渗透压，使细胞脱去部分水，提高材料的抗寒力[18，19]。

2.3 冷冻处理

冷冻处理是超低温保存过程十分重要的步骤，随着保存温度的降低，细胞有形成冰晶的可能。由于植物材料含水量、生理状态等不同，需要的冷冻方法也不相同。冷冻方法可分为快速降温冷冻法、保护性脱水冷冻法和玻璃化冷冻法等[20]。

快速降温冷冻法是将材料从预处理的温度或0℃直接投入到液氮中，在快速降温过程中大大降低了形成晶核的时间，从而避免形成细胞内结晶[16]。此方法适用于含水量少的植物材料，如种子、花粉[21～24]。

保护性脱水冷冻法包括慢速冷冻法、分步冷冻法、逐级冰冻法[20]。此方法适合于含水量较高、液泡化程度较高的愈伤组织、原生质体、悬浮细胞等植物材料。慢速冷冻法是以0.5℃/min～2.0℃/min的降温速度，从预处理温度或0℃降到-30℃、-35℃或-40℃，之后送入液氮中。在此温度梯度下，使植物材料有充足的时间来缓冲细胞内结冰，从而降低植物材料的含水量，达到脱水效果；分步冷冻法是以0.5℃/min～4.0℃/min的降温速度从预处理温度或0℃降至-40℃，停留10min、1h、2h，之后再送入液氮中；逐级冷冻法是将材料经过0℃预冷的冰冻保护剂预处理，再逐级降至-10℃、-15℃、-23℃、-35℃、-40℃等，每级温度停留10min左右，然后送入液氮中[16]。

玻璃化冷冻法是根据玻璃化理论[25]建立的冷冻方法。该方法是在投入液氮之前，在基本培养基中加入高浓度的冰冻保护剂(玻璃化液)，25℃或4℃处理一段时间(一般为10min～60min)，这样可以使细胞在接下来的降温过程中形成玻璃化状态，而无冰晶形成，从而避免损伤细胞，提高材料的存活率。目前，用该方法成功保存了茎尖、原生质体、悬浮细胞[26～28]等。

2.4 材料的化冻洗涤及相对存活率测定

超低温保存材料的化冻方式分为自然化冻法、温水浴快速化冻、自来水冲洗化冻3种类型[29]。合适的化冻方法可以避免细胞内的次生结冰，避免在化冻过程中细胞大量吸水并防止对细胞膜造成伤害。

化冻后的洗涤一般用MS培养基(Murashige and Skoog medium)彻底洗涤后，接种于继代培养基中，培养1个月后，对其进行相对成活率统计。超低温保存材料细胞相对存活率的测定目前广泛采用2，3，5-三苯基氯化四氮唑(TTC)还原法和二醋酸酯荧光素(FDA)染色法。

3 遗传变异特性研究

植物种质资源保存的目的是保证其遗传稳定性，控制遗传性状的基因不发生突变。因此，对超低温保存后的材料的遗传变异特性的研究是十分重要的。近年来，大量科研工作者对超低温保存后的材料的遗传变异特性做了大量的研究和对比分析。目前的研究主要集中在形态学、细胞学、分子生物学3个方面的研究。

3.1 形态学方面的研究

大多数研究者认为，超低温保存后的材料在形态学方面没有明显的变化。 赵喜亭[30]在研究山药超低温保存的再生植株中没有发现形态学特征的变化；Moukadiri等[31]研究水稻愈伤组织超低温保存的再生后代也没有发现形态学特征的变化；石思信等[32]在研究超低温保存1年～2年的玉米花粉的后代植株中，株型、株高、叶色等具有遗传特征的农艺性状与对照组没有明显的差异。但最近也有超低温保存之后部分表型性状发生变化方面的报道。

3.2 细胞学方面的研究

参照唐仙英等[33]的染色体压片技术，艾鹏飞等[34]对超低温保存前、后的柿和君迁子试管苗茎尖研究发现，其染色体条数没有发生改变。

3.3 分子生物学方面的研究

分子生物学方面的研究主要有分子标记、DNA甲基化和DNA含量检测3大类。DNA分子标记是以基本遗传物质脱氧核糖核酸(DNA)的分子差异为基础的一种标记方法。近年来，由于DNA分子标记具有快速、准确可靠、特异性强等优点，应用范围十分广泛，已成为分子遗传学和分子生物学的主要应用技术。目前，被广泛应用的DNA分子标记类型主要有随机扩增多态性(Random amplified polymorphic DNA，RAPD)、扩增片段长度多态性(Amplified fragment length polymorphism，AFLP)、简单重复序列(Simple sequence repeat，SSR)、简单重复间序列(Inter-simple sequence repeat，ISSR)、单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphism，SNP)等。许多研究证明，超低温保存前、后的材料没有发生DNA序列的变异。张艳红[35]研究秦艽超低温保存前后的DNA未发现差异；Turner等[36]检测经过1年超低温保存后的袋鼠花茎尖发现，基因组没有发生遗传变异。但超低温保存后的党参用ISSR标记仅检测出1.1%的变异条带[35]。

DNA甲基化是基因组遗传信息的重要组成部分，是物种遗传多样性形成和体细胞无性系变异的因素之一[37]。一些生物和非生物逆境条件下都能导致DNA甲基化，使其生长发育不正常和形态异常，从而引起表观性遗传变异。何艳霞等[38]研究发现，拟南芥超低温保存后发生了不同程度的甲基化变化。

DNA含量检测主要采用倍性分析仪对保存后的材料进行DNA含量分析。参照张俊娥等[39]检测核DNA含量的方法，艾鹏飞等[34]对柿和君迁子试管苗茎尖玻璃化法超低温保存及再生植株遗传稳定性研究发现，保存前、后的叶片细胞的核DNA含量没有发生改变。

4 现状与展望

自1973年Nag和Street首次报道用液氮保存植物材料以来[3]，世界范围内已对数百种植物种质开展了超低温保存的研究。同时，超低温保存与就地保存和迁地保存等传统方法相比，具有遗传变异小、保存时间长等优点，被认为是长期保存种质资源最有效的方法。我国药用植物资源丰富，超低温保存技术对稀有珍贵的中药材资源的保存提供了一个良好途径。

虽然药用植物资源超低温保存技术已有一定程度的发展，但是与实际生产应用还存在一定差距，许多问题还需要进一步研究探讨，如大部分贮存材料的存活率有待提高，保存后的材料往往只是部分细胞存活，恢复生长时间久。对于保存几十年的材料，遗传变异的问题也有待研究，特别是保存野生稀有植物，同时，建立各类植物的保存体系，更是今后的研究重点。

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