神经节苷脂联合依达拉奉对局灶性脑缺血再灌注大鼠PI3K、Akt蛋白表达的影响研究

张乐，李晓艳，李震，李彬，王娅，姜丹，尹世杰

·临床研究·

神经节苷脂联合依达拉奉对局灶性脑缺血再灌注大鼠PI3K、Akt蛋白表达的影响研究

张乐，李晓艳，李震，李彬，王娅，姜丹，尹世杰

目的观察神经节苷脂联合依达拉奉对大鼠局灶性脑缺血再灌注大鼠缺血半暗带PI3K、Akt蛋白表达的影响，探讨其可能的作用机制。方法线栓法阻塞大鼠左侧大脑中动脉，制作局灶性脑缺血再灌注大鼠模型，脑缺血2 h，再灌注3、7、14 d。随机分为假手术组、模型组、神经节苷脂组、依达拉奉组、神经节苷脂联合依达拉奉组。分别连续给药3、7、14 d，采用免疫组化两步法检测缺血半暗带PI3K、Akt蛋白表达的阳性细胞平均吸收光密度和阳性单位面积。结果在缺血半暗带，再灌注各时间点，模型组PI3K、Akt蛋白表达的平均吸收光密度和阳性单位面积均高于假手术组，差异有统计学意义(P＜0．01);再灌注各时间点，神经节苷脂组、依达拉奉组PI3K、Akt蛋白表达平均吸收光密度和阳性单位面积均高于模型组，差异有统计学意义(P＜0．01);再灌注各时间点，神经节苷脂联合依达拉奉组PI3K、Akt蛋白表达平均吸收光密度和阳性单位面积均高于模型组，差异有统计学意义(P＜0．01);再灌注各时间点，神经节苷脂组、依达拉奉组PI3K蛋白表达平均吸收光密度和阳性单位面积(14 d阳性单位面积除外)均低于神经节苷脂联合依达拉奉组，差异有统计学意义(P＜0．01)。再灌注各时间点，神经节苷脂组、依达拉奉组Akt蛋白表达平均吸收光密度和阳性单位面积(14 d平均吸收光密度值，7 d依达拉奉组阳性单位面积除外)均低于神经节苷脂联合依达拉奉组，差异有统计学意义(P＜0．01)。结论神经节苷脂联合依达拉奉能增强缺血半暗带PI3K、Akt蛋白表达，调节PI3K/Akt信号通路，抗脑缺血神经元凋亡。

神经节苷脂;依达拉奉;脑缺血再灌注;PI3K/Akt信号通路;细胞凋亡

张乐，李晓艳，李震，等．神经节苷脂联合依达拉奉对局灶性脑缺血再灌注大鼠PI3K、Akt蛋白表达的影响研究［J］．实用心脑肺血管病杂志，2015，23(4):142-145．［www．syxnf．net］

Zhang L，Li XY，Li Z，et al．Effect of monosialoganglioside combined with edaravone on expressions of PI3K，Akt protein in ischemic penumbra after focal cerebral ischemia/reperfusion in MCAO rats［J］．Practical Journal of Cardiac Cerebral Pneumal and Vascular Disease，2015，23(4):142-145．

脑血管疾病是中老年人的常见病，以高发病率、高复发率、高致残率、高死亡率为特点，已成为当前疾病三大死亡原因之一。依达拉奉是一种自由基清除剂，可以抑制脑细胞神经元的过氧化损伤，减轻脑缺血引起的脑水肿和组织损害，是一种有效的颅神经保护剂。单唾液酸神经节苷脂(monosialoganglioside，GM1)具有抗兴奋性氨基酸神经毒性、抗氧自由基反应及抗神经元凋亡等作用［1］。脑缺血后，缺血半暗带区的神经元死亡主要以凋亡为主。近年来，PI3K/Akt信号通路在脑缺血神经元凋亡中的调节作用备受关注［2］。本实验采用线栓法阻塞大脑中动脉制作局灶性脑缺血再灌注大鼠模型，观察神经节苷脂联合依达拉奉对模型大鼠缺血半暗带PI3K、Akt蛋白表达的影响，探讨其对脑缺血神经元凋亡的影响及其作用机制。

1 材料与方法

1．1 动物分组健康SD大鼠105只(南京医科大学实验动物中心提供，许可证号SCXK(苏)2002-0031)，雌雄各半，月龄4个月，体质量280～320 g，随机分为假手术组、模型组、依达拉奉组、神经节苷脂组、神经节苷脂联合依达拉奉组，每组21只。分别再分为再灌注3、7、14 d 3个亚组。实验时间为2014-04-16—2014-07-23。

1．2 局灶性脑缺血再灌注模型制备用10%水合氯醛(5．6 ml/kg体质量)腹膜腔注射麻醉大鼠，仰卧位固定，颈部正中切口分离出左侧颈总动脉及其分颈外、颈内动脉，动脉夹夹闭颈总动脉和颈内动脉。结扎颈外动脉的远端，其主干上剪一小口，将尼龙线栓沿切口内推进18～22 mm，微遇阻力时即到了大脑中动脉起始部，实现左侧大脑中动脉的完全阻塞，此时可移去颈总动脉的动脉夹。剪断血管外长约10 mm的线栓，留残端1～2 cm。再灌注时缓慢拉出线栓至颈内动脉，大脑中动脉即可恢复血流。

1．3 药物与试剂依达拉奉注射液由吉林博大制药有限责任公司提供(规格:30 mg/20 ml，批号:01-140112)，单唾液酸神经节苷脂由山东齐鲁制药有限公司提供(规格:20 mg/2 ml，批号:4010081)。PI3K、Akt抗体、DAB显色试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司，Envision两步法试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司。

1．4 给药剂量与方法依达拉奉注射液，剂量3 mg/kg，应用0．9%氯化钠溶液稀释成浓度1 mg/ml，腹腔注射，2次/d;单唾液酸神经节苷脂，剂量20 mg/kg，用0．9%氯化钠溶液稀释成浓度1 mg/ml，腹腔注射，1次/d。假手术组、模型组用等量0．9%氯化钠溶液腹腔注射。

1．5 取材分别于脑缺血2 h，再灌注3、7、14 d，采用10%水合氯醛麻醉(3．6 ml/kg体质量，腹腔注射)大鼠，打开胸腔，于右心耳部剪一小口，从左心室插入导管至主动脉，向内快速注入37℃肝素化0．9%氯化钠溶液250 ml，至右心耳流出液变清亮，然后注入40 g/L多聚甲醛磷酸盐缓冲液250 ml，灌流固定30 min后断头取脑，除去小脑和脑干，取大脑，放入40 g/L多聚甲醛磷酸盐缓冲液中固定1周，脱水、透明、浸蜡，在视交叉前后连续制作脑部冠状切片。

1．6 免疫组化两步法检测采用Envision两步法进行免疫组化染色，DAB显色液显色，PI3K、Akt抗体稀释浓度为1∶150，采用正常山羊血清替代一抗作为阴性对照，苏木素轻度复染。1．7统计学方法根据大鼠脑缺血半暗带的定位方法［3-4］，

大脑中动脉阻塞的同侧额顶叶皮质上部界定为半暗带的等值观察区，采用南京捷达JD-801图像分析系统，在相同视野下，分别对相邻切片的PI3K、Akt蛋白免疫反应阳性细胞的平均吸收光密度和阳性单位面积进行分析。所得数据采用SPSS 16．0统计软件进行统计分析。计量资料以(±s)表示，组间比较采用方差分析，两两比较采用q检验。以P＜0．05为差异有统计学意义。

2 结果

2．1 神经节苷脂联合依达拉奉对局灶性脑缺血再灌注大鼠PI3K蛋白表达的影响脑缺血2 h，再灌注各时间点，模型组PI3K蛋白表达阳性单位面积和平均吸收光密度均高于假手术组，差异有统计学意义(P＜0．01);再灌注各时间点，神经节苷脂联合依达拉奉组PI3K蛋白阳性单位面积和平均吸收光密度均高于模型组，差异有统计学意义(P＜0．01);再灌注各时间点，神经节苷脂组、依达拉奉组PI3K蛋白表达平均吸收光密度和阳性单位面积均高于模型组，差异有统计学意义(P＜0．01);再灌注各时间点，神经节苷脂组、依达拉奉组PI3K蛋白表达平均吸收光密度和阳性单位面积(14 d阳性单位面积除外)均低于神经节苷脂联合依达拉奉组，差异有统计学意义(P＜0．01，见表1)。

假手术组缺血半暗带PI3K蛋白见少量表达。脑缺血2 h，再灌注各时间点，模型组PI3K蛋白表达明显增强，主要表达于半暗带神经元胞浆。再灌注各时间点，神经节苷脂联合依达拉奉组PI3K蛋白表达明显增强，多在神经元胞浆中有着色;再灌注各时间点，神经节苷脂组、依达拉奉组PI3K蛋白表达高于模型组，在神经元胞浆中表达明显。再灌注各时间点，神经节苷脂组、依达拉奉组PI3K蛋白表达显著低于神经节苷脂联合依达拉奉组，神经元胞浆表达减少(见图1)。

表1 各组缺血2 h再灌注不同时间缺血半暗带PI3K蛋白表达阳性细胞的平均吸收光密度值和阳性单位面积比较(±s)Table 1 Comparison of average absorption optical density and positive area of ischemic penumbra PI3K protein-positive cells in the different times after local cerebral ischemia for 2 h in all groups

表1 各组缺血2 h再灌注不同时间缺血半暗带PI3K蛋白表达阳性细胞的平均吸收光密度值和阳性单位面积比较(±s)Table 1 Comparison of average absorption optical density and positive area of ischemic penumbra PI3K protein-positive cells in the different times after local cerebral ischemia for 2 h in all groups

注:与假手术组比较，*P＜0．01;与模型组比较，#P＜0．01;与依达拉奉组比较，▲P＜0．01;与神经节苷脂组比较，△P＜0．01

组别只数阳性单位面积(×102)平均吸收光密度0．820 0．120±0．008 0．122±0．009模型组21 18．99±0．86*20．24±1．11*18．58±0．72*0．172±0．004*0．188±0．009*0．178±0．009*依达拉奉组21 21．93±1．07#25．90±0．90#24．96±1．75#0．217±0．016#0．252±0．007#0．245±0．006#神经节苷脂组21 22．07±1．04#26．04±0．61#25．02±1．55#0．217±0．011#0．259±0．007#0．249±0．004#依达拉奉+神经节苷脂组21 24．46±0．73#▲△27．63±0．71#▲△26．66±1．28#0．267±0．007#▲△0．276±0．011#▲△0．265±0．006#▲△3 d 7 d 14 d假手术组21 14．25±0．63 14．09±1．07 14．09±1．07 14．450± 3 d 7 d 14 d

图1 Envsion两步法检测缺血半暗带PI3K蛋白的表达情况(DAB染色，×400)Figure 1 The expression of ischemic penumbra PI3K protein by Envsion two-step method

2．2 神经节苷脂联合依达拉奉对局灶性脑缺血再灌注大鼠Akt蛋白表达的影响脑缺血2 h，再灌注各时间点，模型组Akt蛋白表达的阳性单位面积和平均吸收光密度均高于假手术组，差异有统计学意义(P＜0．01);再灌注各时间点，神经节苷脂联合依达拉奉组Akt蛋白表达的阳性单位面积和平均吸收光密度均高于模型组，差异有统计学意义(P＜0．01);再灌注各时间点，神经节苷脂组、依达拉奉组Akt蛋白表达的平均吸收光密度和阳性单位面积(依达拉奉组3 d阳性单位面积除外)均高于模型组，差异有统计学意义(P＜0．01);再灌注各时间点，神经节苷脂组、依达拉奉组Akt蛋白表达的平均吸收光密度和阳性单位面积(14 d平均吸收光密度值，7 d依达拉奉组阳性单位面积除外)均低于神经节苷脂联合依达拉奉组，差异有统计学意义(P＜0．01，见表2)。

假手术组缺血半暗带Akt蛋白见少量表达;脑缺血2 h，再灌注各时间点，模型组Akt蛋白表达明显增强，主要表达于半暗带神经元胞核，显著高于假手术组。再灌注各时间点，神经节苷脂联合依达拉奉组Akt蛋白表达明显增强，高于模型组，多在神经元胞核中着色;再灌注各时间点，神经节苷脂组、依达拉奉组Akt蛋白表达显著高于模型组，以神经元胞核表达明显;再灌注各时间点，神经节苷脂组、依达拉奉组Akt蛋白表达显著低于神经节苷脂联合依达拉奉组，神经元胞核表达减少(见图2)。

3 讨论

局灶性脑缺血病灶由缺血中心区和周围的半暗带组成，细胞凋亡是脑缺血中最重要的发病环节，缺血再灌注时产生的氧自由基可导致脂质过氧化反应从而改变其功能，细胞膜通透性

增强，线粒体肿胀破裂并诱发细胞凋亡，其主要发生在半暗带。目前认为细胞凋亡是细胞在各种死亡信号刺激后发生的一系列级联激活的主动性细胞死亡过程，表现为凋亡基因的表达和相关信号转导通路的激活。如果能阻止凋亡的发展，就有可能减轻脑缺血时脑损伤程度，缩小梗死范围，因此脑缺血后神经元凋亡机制以及基于细胞凋亡为靶点的抗脑缺血研究成为研究的热点［5］。

表2 各组缺血2 h再灌注不同时间缺血半暗带Akt蛋白表达阳性细胞的平均吸收光密度值和阳性单位面积(±s)Table 2 Comparison of average absorption optical density and positive area of ischemic penumbra Akt protein-positive cells in the different times after local cerebral ischemia for 2 h in all groups

表2 各组缺血2 h再灌注不同时间缺血半暗带Akt蛋白表达阳性细胞的平均吸收光密度值和阳性单位面积(±s)Table 2 Comparison of average absorption optical density and positive area of ischemic penumbra Akt protein-positive cells in the different times after local cerebral ischemia for 2 h in all groups

注:与假手术组比较，*P＜0．01;与模型组比较，#P＜0．01;与依达拉奉组比较，▲P＜0．01;与神经节苷脂组比较，△P＜0．01

组别只数阳性单位面积(×102)平均吸收光密度．008 0．107±0．011 0．107±0．011模型组21 16．30±0．71*16．78±0．50*15．99±0．55*0．160±0．010*0．166±0．006*0．160±0．004*依达拉奉组21 17．74±1．64 22．22±0．83#18．94±0．91#0．198±0．014#0．224±0．010#0．216±0．014#神经节苷脂组21 18．39±0．68#21．82±0．68#21．56±0．78#0．198±0．012#0．225±0．010#0．213±0．009#依达拉奉+神经节苷脂组21 22．02±0．93#▲△23．24±1．11#△22．52±0．85#▲△0．230±0．016#▲△0．241±0．011#▲△0．224±0．012 3 d 7 d 14 d假手术组21 10．85±0．74 10．78±0．72 10．74±1．04 0．110±0 3 d 7 d 14 d #

图2 Envsion两步法检测缺血半暗带Akt蛋白的表达情况(DAB染色，×400)Figure 2 The expression of ischemic penumbra Akt protein by Envsion two-step method

PI3K/Akt信号通路是近年来研究的一条重要的抗凋亡信号通路，PI3K是一种胞内磷脂酰肌醇激酶，当受到来自G蛋白耦联受体或酪氨酸激酶的信号后，PI3K的p110亚基与p85亚基结合而活化Akt，激活的Akt能够向细胞质和细胞核内转运，活化的Akt通过磷酸化作用激活或抑制下游靶蛋白，进而调节细胞的凋亡、增殖、分化、迁移等过程。

本实验研究发现在缺血半暗带，再灌注各时间点，模型组PI3K、Akt蛋白平均吸收光密度和阳性面积高于假手术组，说明局灶性脑缺血再灌注存在PI3K/Akt信号通路变化。有学者研究大鼠脑缺血再灌注缺血半暗带侧神经元凋亡及p-Akt (Ser473)表达情况，发现大鼠脑缺血再灌注侧p-Akt (Ser473)表达增加［6］。本研究还发现，再灌注各时间点，神经节苷脂联合依达拉奉组PI3K、Akt蛋白平均吸收光密度和/或阳性面积高于模型组;再灌注各时间点，神经节苷脂组、依达拉奉组PI3K、Akt蛋白平均吸收光密度和阳性面积多高于模型组;再灌注各时间点，神经节苷脂联合依达拉奉组PI3K、Akt蛋白平均吸收光密度和阳性面积多高于神经节苷脂组或依达拉奉组，推测神经节苷脂联合依达拉奉能增强缺血半暗带PI3K、Akt蛋白表达，调节PI3K/Akt信号通路，抗脑缺血神经元凋亡。但PI3K/Akt信号通路及其相关分子如何实现对神经元凋亡的调控以及分子机制有待进一步的研究。

［1］杜江，铁欣昕，欧绍武．神经节苷脂对脑缺血再灌注大鼠海马Fas表达的影响［J］．天津医药，2013，41(7):686-688．

［2］Yuan Y，Guo Q，Ye Z，et al．Ischemic postconditioning protects brain from ischemia/reperfusion injury by attenuating endoplasmic reticulum stress-induced apoptosis through PI3K-Akt pathway［J］．Brain Res，2011，1367:85-93．

［3］Longa EZ，Weinstein PR，Carlson S，et al．Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats［J］．Stroke，1989，20(1):84-91．

［4］Bannister CM，Chapman SA．Ischemia and revascularization of the middle cerebral territory of the rat brain by manipulation of the blood vessels in the neck［J］．Surg Neurol，1984，21(4):351-357．

［5］Ma Y，Li Y，Zhang C，et al．Neuroprotective effect of 4-methylcyc lopen-tadecanone on focal cerebral ischemia/reperfusion injury in rats［J］．J Pharmacol Sci，2014，125(3):320-328．

［6］葛宇松，刘雪松，薛俊燕，等．丁苯酞注射液预处理通过PI3K/ Akt通路对大鼠脑缺血再灌注损伤的神经保护作用［J］．中风与神经疾病杂志，2013，30(1):32-36．

Effect of M onosialoganglioside Combined w ith Edaravone on Expressions of PI3K，Akt Protein in Ischem ic Penum braafter Focal Cerebral Ischem ia/Reperfusion in MCAO rats

ZHANG Le，LI Xiao-yan，LI Zhen，et al．
Anhui Province No．2 People's Hospital，Hefei 200041，China

Objective To investigate the effect of Monosialoganglioside and Edaravone on expressions of PI3K，Akt protein in ischemic penumbra after local cerebral ischemia/reperfusion in intraluminal thread occlusion of the middle cerebral artery(MCAO)rats and its related mechanism．M ethods The local cerebral ischemia/reperfusion model was established by intraluminal thread occlusion of the middle cerebral artery．The animals were randomly divided into pseudo surgery group(sham group)，model(MCAO)group，Monosialogangli oside group，Edaravone group and Monosialoganglioside combined Edaravone group．Using the techniques of immuno-histochemical sraining，the expressions of PI3K，Akt protein were observed at 3，7 and 14 days in ischemic penumbra．Results The A value and positive area of PI3K，Akt protein expression in model group were higher than those in sham group(P＜0．01)．The A value and positive area of PI3K，Akt expressions in Monosialoganglioside group and Edaravone group were higher than those in MCAO group(P＜0．01)．Compared with the model group，the A value and positive area of PI3K，Akt expressions increased more significantly in Monosialoganglioside combined Edaravone group(P＜0．01)．The A value and positive area of PI3K protein expression reduced more obviously in Monosialoganglioside group and Edaravone group than in Monosialoganglioside combined Edaravone group(except the A value and positive area of PI3K protein expression on the 14th day)(P＜0．01)．Compared with the Monosialoganglioside combined Edaravone group，the A value and positive area of Akt protein expression reduced significantly in the Monosialoganglioside group and Edaravone group(except the A value on the 14th day and the positive area on the 7th day in the Edaravone group)(P＜0．01)．Conclusion Monosialoganglioside and Edaravone can resist neural cell apoptosis，regulate PI3K/Akt signal transduction pathway by enhancing PI3K，Akt protein expression after local cerebral ischemia/reperfusion in MACO rats．

Monosialoganglioside;Edaravone;Brain ischemia/reperfusion;PI3K/Akt signal transduction pathway; Apoptosis

R 743

B

10．3969/j．issn．1008-5971．2015．04．049

2015-01-20;

2015-03-20)

(本文编辑:崔沙沙)

230041安徽省合肥市，安徽省第二人民医院