多种植物提取物对DMPD自由基清除作用的研究

刘国安， 常锦春， 乔想金， 何彩丽， 邹柯姝， 丁 兰

(西北师范大学 生命科学学院， 兰州 730070)



多种植物提取物对DMPD自由基清除作用的研究

刘国安*， 常锦春， 乔想金， 何彩丽， 邹柯姝， 丁 兰

(西北师范大学 生命科学学院， 兰州 730070)

用DMPD法检测了植物来源的天然产物对DMPD˙+自由基的清除作用. 结果表明，11种单体化合物和沙棘籽油在此反应体系表现出不同的活性. 黄酮类化合物中槲皮素活性最强，100 μmol/L时清除率为55.76%，芦丁和葛根素居中，分别是16.64%、2.25%，芹菜素最弱，此浓度未检测到清除作用；酚类化合物中阿魏酸的活性最强，100 μmol/L时达96.78%；三萜化合物熊果酸较齐墩果酸作用强，1 μmol/L时检测到清除活性达到最高，分别为23.05%和3.05%；混合物沙棘籽油对DMPD˙+自由基有一定的清除能力，其半清除浓度为12.84 mg/mL. 此结果为这些植物来源化合物发挥抗氧化作用的合理浓度范围及进一步应用提供了一定的依据．

DMPD； 自由基清除作用； 植物抗氧化剂

自由基(free radicals)和活性氧(active oxygen species，ROS)的重要性近几十年得到了极大的关注，ROS是细胞代谢的正常产物，主要包括超氧阴离子(O2˙ˉ)，羟自由基(HO˙)，过氧化氢(H2O2)和单线态氧(1O2). 研究发现，ROS在细胞损伤和衰老，信号途径的激发当中扮演着重要角色，此外，癌症及很多其他疾病的发生和发展与ROS密切相关. 人体代谢中如果ROS水平过高，会通过增加DNA的突变或者诱导DNA损伤，基因组的不稳定以及细胞的增殖来诱导癌症的发生与发展[1]. 机体本身的各种抗氧化酶和抗氧化成分会清除过量的ROS，但由于某些原因导致平衡被破坏，机体将会处于氧化胁迫(oxidative stress)状态，摄入抗氧化剂就有可能会逆转胁迫，保护细胞免于活性氧的侵害，进而阻止或延缓许多慢性疾病的发生和发展[2]. 已知许多种类的植物化学成分比如维生素、多酚、黄酮类、类胡萝卜素能够清除自由基及ROS[3]. 检测化合物抗氧化的指标很多，如清除羟自由基或超氧阴离子等，但单一的体系不能全面反应待测物的活性，因此，多种指标检测的综合结果才能说明物质的总体活性．

N，N-二甲基-对苯二胺(N，N-dimethyl-p-phenylendiamine， DMPD)法检测物质对自由基清除作用，是近年来发展起来的一种用来测定天然产物潜在抗氧化活性的方法. 酸性条件下，DMPD可被ABAP、FeC13、CuC12氧化生成稳定有颜色的DMPD˙+自由基，其在505 nm处有最大吸收峰. 当加入抗氧化剂时，能转移1个氢原子给DMPD˙+，使溶液脱色，脱色程度越强，说明样品的抗氧化能力越强[2]. DMPD的吸光值在室温下12 h内基本恒定，尤其适合含水食品提取物的大规模筛选，此反应迅速、稳定、容易操作而且成本低，其他测定总体氧化状态的方法都相对耗时并且涉及多个步骤[4]，所以此方法可用来大规模筛选抗氧化剂，并比较不同抗氧化剂在同一体系当中清除自由基的活性. DMPD法现在已经广泛用来测定许多样品的抗氧化能力，如水果、蔬菜、葡萄酒[5]以及蛋白质中的不稳定硫化物，绿茶提取液抗氧化活性和人体血浆的氧化还原状态[6]．

本实验中，用DMPD法测定了单体化合物槲皮素、芦丁、芹菜素、葛根素、白藜芦醇、阿魏酸，迷迭香酸、香兰素、茜素红、熊果酸和齐墩果酸以及混合物沙棘籽油对DMPD˙+自由基的清除活性，比较这些化合物在此体系中清除自由基的活性，并验证混合物沙棘籽油的抗氧化活性. 为这些植物成分在保健以及医药领域中的应用提供一定的科学依据. 各种成分的化学结构式见图1．

图1 化合物化学结构式

1 实验材料与方法

1.1 实验材料

槲皮素、芦丁、芹菜素、葛根素、白藜芦醇、阿魏酸、迷迭香酸、香兰素、茜素红、熊果酸、齐墩果酸为西安慧科生物公司产品，沙棘籽油购买自甘肃天工生物科技有限公司. DMPD为Sigma产品，其余试剂均为国产分析纯．

1.2 实验方法

1.2.1 沙棘籽油的乳化 沙棘籽油本身是油系，体外研究其抗氧化活性因反应体系的水性体系必须将其转化成水系. 参照做微乳的思路，制备沙棘籽油自乳化乳剂[7-8]. 以沙棘籽油作油相，取沙棘籽油加入司盘80不断吸打，分散均匀.水浴55～60℃，保温60 min左右，在此期间每5 min吸打一次，另取吐温80、OP-10和丙二醇溶于55～60℃蒸馏水中，摇匀后缓慢加入上述保温60 min的油相中，继续每5 min吸打一次，使其分散均匀，10～15 min后制成初乳，并对其稳定性进行检验[9]．

1.2.2 对DMPD˙+清除能力测定 清除DMPD˙+能力的测定根据Foglian等[10]的方法，稍作修改. 将0.1 mol/L、pH 5.25的醋酸盐缓冲液和100 mmol/LDMPD溶液混匀，再加入0.05 mol/LFeC13溶液启动反应，产生DMPD˙+溶液. 在不同浓度的样品溶液中分别加入1 mL DMPD˙+溶液，在25℃下反应10 min，505 nm处测吸光值. 清除率的计算如下：

DMPD˙+清除率=( 1-A505-1/A505-2) ×100%,

其中，A505-2为DMPD˙+初始浓度的吸光值；A505-1为存在待测剂时剩余DMPD˙+浓度的吸光值. 所有实验重复3次以上．

2 实验结果

2.1 沙棘籽油乳化及稳定性结果

沙棘籽油经过乳化之后，制得的乳剂样品轻度油水分层，微量漂油，将乳化后的沙棘籽油在室温下放置2 d，可见轻度油水分层，油层为整个乳液样品的2%～3%，下层水相清澈透明，在整个实验过程中能够保持较好的稳定性，符合稳定性要求．

2.2 多种天然产物对DMPD˙+自由基的清除作用

2.2.1 4种黄酮化合物对DMPD˙+自由基的清除作用 从结果(图2)可看出，槲皮素在较低浓度(1 μmol/L)就表现出清除作用，浓度为100 μmol/L时对DMPD˙+自由基的清除率为55.76%，但是随着浓度升高，其对DMPD˙+自由基的清除作用并没有相应的升高，当槲皮素的浓度为250、500 μmol/L时，其清除率分别为77.52%、72.95%. 葛根素属于异黄酮的甙类，此体系中对DMPD˙+自由基有较弱的清除作用并呈浓度依赖性，浓度达100 μmol/L时清除率仅为2.25%，随着浓度的增大清除率升高，1 000 μmol/L时清除率达55.24%. 但同样作为黄酮类的芦丁，在浓度达100 μmol/L时其清除率仅为16.64%，高浓度时体系的吸光值增加，表现出促进DMPD˙+自由基生成的作用(实验中，已将芦丁的颜色和沉淀造成的光吸收值除去).而同样属于黄酮化合物的芹菜素，不仅在低浓度时未检测到清除作用，在高浓度下反而有促进DMPD˙+自由基生成的作用. 以上这些结构不同的黄酮类化合物在浓度为100 μmol/L时对DMPD˙+自由基清除能力的强弱排序为槲皮素>芦丁>葛根素，芹菜素无清除作用.

2.2.2 5种酚类化合物对DMPD˙+自由基的清除作用 与黄酮类物质不同，酚类化合物白藜芦醇，阿魏酸在较低浓度(1 μmol/L)就表现出清除作用，并且随着浓度增大清除作用也加强(图3)，两者在100 μmol/L时清除率分别为89.71%和96.78%. 但是同样作为酚酸类化合物的迷迭香酸却对DMPD˙+自由基清除作用较弱，同样浓度下清除率仅为32.57%. 天然植物香料香兰素在低浓度时清除作用也较弱，但随着浓度升高清除作用增强，在1000 μmol/L时清除率达到60.28%. 此组茜素红的作用最弱，仅在0.1 μmol/L时表现出清除能力(9.73%)，浓度提高后也表现出促氧化作用.

图3 酚类化合物对DMPD˙+的清除作用

2.2.3 三萜和沙棘籽油对DMPD˙+自由基的清除作用 三萜化合物熊果酸和齐墩果酸在植物中最常见. 本实验中熊果酸比墩果酸的作用强，虽然两者都在1 μmol/L时清除活性达到最高，但清除率分别为23.05%和3.05%(图4)，齐墩果酸的活性约为后者的8倍. 提高浓度后并没有检测到更强的清除作用．

与上述所有化合物不同，沙棘籽油是多种成分的混合物. 对DMPD˙+自由基有着较强的清除作用，在较低浓度就表现活性，并呈浓度依赖性. 当沙棘籽油浓度为1.922 mg/mL时就表现出较高清除作用(21.62%)，回归分析表明，当其对DMPD˙+自由基的清除率达到50%时，沙棘籽油浓度为12.84 mg/mL.

图4 三萜和沙棘籽油对DMPD˙+的清除作用

3 讨论

正常情况下人体内自由基或ROS是处于不断产生与消除的动态平衡中，不致产生危害. 但若代谢紊乱，如缺乏维生素及微量元素等营养物质，以及药物产生的自由基、高压氧等因素均会促进氧自由基的生成，进而引发脂质过氧化，造成生物膜功能和结构的破坏，这些损伤可能和衰老、癌症或心血管等慢性疾病的发生与发展有关[11]. 在理论上，通过添加外源性抗氧化剂就可能增加自身清除ROS的能力或减少ROS的产生. 但在实践中盲目地使用抗氧化剂，有时候不仅不能有效发挥机体抗氧化能力，反而有可能使得氧化应激更加严重[12]. 因此对不同的抗氧化剂起到抗氧化作用浓度范围的确定是非常必要的. 本文使用DMPD法测定了一些天然产物对DMPD˙+自由基的清除能力，比较它们在这一体系当中抗氧化能力的强弱．

从植物当中获得的天然提取物，很多成分具有良好的抗菌、抑菌效果. 槲皮素是食品和中药中最常见的黄酮类抗氧化剂，芦丁是槲皮素的芸香糖甙. 研究表明，在黄酮的结构中，除了抗氧化活性必需的功能团，增加羟基的数量可增加其抗氧化活性[13]. 本实验体系中芦丁对DMPD˙+自由基的清除作用远低于槲皮素，说明由于糖甙的形成取代了槲皮素当中的一个羟基所以降低了其清除DMPD˙+自由基的活性，在H2O2诱导的星形胶质细胞氧化损伤和大鼠脑脂质过氧化的保护作用当中，槲皮素的活性也大于芦丁[14]. 葛根素属于异黄酮甙类化合物，是中药葛根的有效成分，它对于超氧阴离子和羟自由基有清除作用[15]， 本实验中检测到对DMPD˙+自由基有较强的清除作用，说明这种异黄酮结构含有的两个酚羟基是其较高抗氧化活性的基础. 芹菜素，化学名为4'，5，7-三羟基黄酮，在以前的实验中发现，相比白藜芦醇、茜素红、葛根素、阿魏酸，芹菜素抑制脂质过氧化和保护牛血清白蛋白氧化降解的作用较弱[16]. 而本实验未检测到它对DMPD˙+自由基的清除作用，说明该化合物虽然有3个羟基，但在这些体系中却不能很好地发挥作用，在此反应体系中溶解度较低可能影响了其活性，这可能与姜黄素在这一体系当中敏感性和再现性较低原因相似[17].

白藜芦醇是近年来研究较多的多酚抗氧化剂，存在于葡萄科、百合科、豆科等70多种植物中[18]，阿魏酸是酚酸类化合物，两者都由于其羟基取代的高反应性和吞噬自由基能力而有很好的抗氧化活性[19]，本实验中对DMPD˙+自由基也具有很强的清除作用，说明了其抗氧化的广谱性. 迷迭香酸是含多酚羟基的酸，能抑制中性粒细胞超氧阴离子、过氧化氢以及丙二醛的产生[20]，它对DMPD˙+自由基也具一定的清除作用. 这些酚酸化合物抗氧化性能基本都源于分子中酚羟基的脱氢能力及苯环上邻、对位取代基的影响[21]. 香兰素作为用途广泛的香料，本体系中对DMPD˙+自由基的清除作用明显，其他研究发现能够清除辐射产生的自由基，抑制X射线作用后所诱导的DNA单链断裂[22]，表明其抗氧化作用具有普遍性. 茜素红属于蒽醌类化合物，在本体系中只有在0.001～0.1 μmol/L的浓度范围内表现出清除作用，说明茜素红对DMPD˙+自由基清除作用有限．

三萜化合物是香茶菜属植物中的主要次生代谢产物，熊果酸、齐墩果酸在低浓度条件下表现出清除作用，但是齐墩果酸对DMPD˙+自由基清除作用低于熊果酸，对比两者的结构式可知，仅一个-CH3的位置不同，就可以引起较大的活性改变. 据报道，在医学研究和临床上，沙棘籽油对慢性支气管炎、胃溃疡、缺血性心脏病等具有较好的疗效[23]. 但其抗氧化活性研究未见报道. 沙棘籽油中含有亚油酸、类胡萝卜素、维生素E、黄酮等生物活性成分，本实验中其半清除浓度为12.84 mg/mL，对DMPD˙+自由基的清除具一定的活性，可能其含有的多种成分共同参与了对DMPD˙+自由基的清除. 其抗氧化活性可能参与了药理作用的发挥．

总体来说以上几组化合物中白藜芦醇和阿魏酸等几种酚类清除作用最强，黄酮类中只有槲皮素活性较强，三萜化合物熊果酸有一定作用，沙棘籽油也具有较高的活性．

综上所述，本实验用DMPD法测定了11种单体化合物以及混合物沙棘籽油对DMPD˙+自由基的清除活性，这不仅比较了这些成分清除DMPD˙+自由基的活性，也为这些植物来源化合物抗氧化作用浓度范围的确定提供一定的依据．

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The study on the DMPD free radical scavengation by some plant extract

LIU Guoan, CHANG Jinchun, QIAO Xiangjin, HE Caili, ZOU Keshu, DING Lan

(College of Life Science, Northwest Normal University， Lanzhou 730070)

The DMPD assay was used for evaluating scavenging effect of several botanical products on free radical DMPD˙+. The results indicated that 11 kinds of monomeric compounds and sea-buckthorn seed oil exhibited different antioxidant activities in this system. In flavonoids group, quercetin displayed the strongest scavenging capacity, apigenin showed the weakest, rutin and puerarin were medium , at 100 μmol/L, the clearance rate was 55.76%, 16.64%, 2.25% and non-scavenging, respectively. As phenolic compounds, ferulic acid showed the strongest action, the clearance rate reached 96.78% at 100 μmol/L. Triterpenoids ursolic acid exhibited more effective than oleanolic acid, at 1 μmol/L they exhibited the highest scavenging rate, 23.05% and 3.05%, respectively. Sea-buckthorn seed oil had the definite effect, the half clear concentration is 12.84 mg/mL. The results provided date to the further use and reasonable concentration in application of these compounds．

DMPD; radical scavenging effect; botanical antioxidants

2014-09-30.

国家自然科学基金项目(30960464);教育部留学回国人员科研启动基金项目.

1000-1190(2015)01-0102-06

Q591

A

*E-mail: liuguoan@nwnu.edu.cn.