参麦注射液联合化疗对结直肠癌Lovo细胞的增殖抑制作用*

李 俊

上海梅山医院肿瘤科 (南京210001)

参麦注射液联合化疗对结直肠癌Lovo细胞的增殖抑制作用*

李 俊

上海梅山医院肿瘤科 (南京210001)

目的：探讨参麦注射液在肿瘤抗血管生成作用的时间窗问题，即最佳用药时间。方法：建立荷瘤小鼠模型，观察参麦注射液联合草酸铂/氟尿嘧啶抑制肿瘤增殖作用并观察荷瘤小鼠生存期的影响。结果：参麦联合化疗对人肠癌LOVO细胞及HUVEC的增值抑制作用最明显，效果高于相同剂量化学药物或单药参麦注射液。动物实验结果表明，先给予参麦注射液后给予奥沙利铂对肠癌Lovo荷瘤裸鼠皮下移植瘤的抑制作用最大，瘤体体积及重量最小，对肿瘤细胞的杀伤作用最为明显，癌细胞体积减少明显。结论：化疗前给药可能是参麦注射液的抗血管生成最佳治疗时间，确切机制仍需进一步探讨研究。

结直肠癌是消化道最常见的恶性肿瘤之一，有逐年上升的趋势[1]。中医药以其独特的优势在大肠癌的治疗中发挥了不可替代的作用，其在抗肿瘤新生血管生成的作用受到人们的广泛关注[2]。参麦近年来研究有一定的抗血管生成作用，参麦注射液联合化疗药物使用时可起到协同抗血管生成作用，能起到更好的抑制肿瘤细胞的效果[3]。

本研究通过体外细胞培养技术和动物实验进一步阐明参麦注射液的抑制肿瘤血管生成作用和化疗协同作用。建立荷瘤小鼠模型，观察参麦注射液联合草酸铂/氟尿嘧啶抑制肿瘤增殖作用并观察荷瘤小鼠生存期的影响；体外培养人脐静脉内皮细胞(HUVEC)，观察参麦注射液抑制血管内皮增殖作用；观察参麦注射液增加上述化疗药物对肠癌细胞系的抑制作用。采用参麦注射液协同化疗药物对体外培养的小鼠肠癌细胞的协同增敏制作用，探讨参麦注射液在肿瘤抗血管生成作用的时间窗问题，即最佳用药时间。

1 实验选材与实验方法 1.1 实验选用动物、细胞及实验试剂 BALB/ c 裸鼠共计30只，约6～7 周龄，体重介于16～21g，要求均为雌性，购自生物技术公司，饲养于SPF环境。人肠癌Lovo细胞购自南京凯基生物技术公司，HUVEC细胞为本实验室自建，培养于RPMI1640培养基，培养基中含10 %新生牛血清，养护条件为37℃、5 %CO2孵箱。奥沙利铂(江苏恒瑞公司)；参麦注射液(正大青春宝公司)；RPMI1640培养基(Gibco BRL) 、新生牛血清(杭州四季青公司) 、四甲基偶氮唑蓝(MTT ,Sigma) 、二甲基亚砜(DMSO ,Sigma) 。

1.2 人肠癌Lovo细胞的复苏与培养 取冻存的人肠癌LoVo细胞，复苏后培养于由RPMI1640培养液中，放置于37℃,5%CO2培养箱中，细胞每2d更换新鲜培养液。

1.3 MTT法检测单纯奥沙利铂(以下用OXA代替) 参麦联合OXA对人肠癌LoVo细胞和HUVEC细胞的杀伤活性。

1.3.1 取对数生长期的人肠癌LoVo细胞，采用PBS液配置浓度为1×106/mL细胞悬液，接种于多孔板中，孔板选用180uL/孔，96孔；分别配置不同浓度的化疗药和参麦注射液浓度，设生理盐水对照组，每组选定3个复孔，置于培养箱中培养48h(培养箱为37℃、5%CO2)，加入MTT 10uL，同样条件继续培养4h，弃上清，加入DMSO100uL。采用酶标仪选用570nm波长测各孔的吸光度A值，以此计算细胞存活率，采用公式为：存活率=(实验组A值/对照组A值)×100%，绘制浓度效应曲线，将药物浓度定为横轴，存活率定为纵轴，确定半数抑制(IC50)浓度。

1.3.2 常规分离培养HUVEC,在含VEGF、B-FGF的EDMM内皮细胞条件培养液培养；加入梯度浓度的参麦注射液、OXA诱导，设生理盐水对照组，每组选定3个复孔，置于培养箱中培养48h(培养箱为37℃、5%CO2)，加入MTT 10uL，同样条件继续培养4h，取出弃上清，加入DMSO100uL。采用酶标仪选用570nm波长测各孔的吸光度A值，以此计算细胞存活率，采用公式为：存活率=(实验组A值/对照组A值)×100%，绘制浓度效应曲线，将药物浓度定为横轴，存活率定为纵轴，确定半数抑制(IC50)浓度。

1.4 动物实验体内抑制肿瘤作用 将处于对数生长期的人肠癌Lovo细胞注射于BALB/c裸鼠的右侧后肢根部皮下，数量为2×10^6/mL个，体积均为0.1mL/只。2周后选择荷瘤大小近似的裸鼠共计15只，随即分为生理盐水(对照组)、OXA组，参麦联合OXA组，每组各5只。OXA组腹腔内注射1mg/kg的奥沙利铂0.2mL/只，隔日1次，共3次；参麦联合OXA组，先给予参麦注射液，0.2mL/只，隔日1次，共3次，再给予奥沙利铂0.2mL/只，隔日1次，共3次；NS组腹腔内注射生理盐水，同样为0.2mL/只，隔日1次，共3次。从治疗开始每两天用游标卡尺测量肿瘤的最大纵径(a)及最大横径(b)，计算肿瘤体积=0.5×a×b2，观察肿瘤的生长状况。治疗后第15d采用颈椎脱臼法处死所有实验动物，取下移植瘤，测量各瘤重，分别计算各组荷瘤鼠的瘤重抑瘤率(TWI)，公式为：TWI%=(1-治疗组平均瘤重/生理盐水对照组平均瘤重)×100%，将瘤体组织置于4%甲醛溶液中固定，送IHC。

1.5 微血管浓度计算 瘤组织石蜡切片采用SP法染色，操作步骤按试剂盒要求，滴加羊抗小鼠CD31单抗，以PBS代替一抗作对照，HRP标记的兔抗羊多克隆抗体作为二抗，采用标准IHC检测流程，以已知阳性的切片作阳性对照。CD31标记微血管，计数肿瘤内着色的毛细血管和微小血管。

2 结 果 2.1 参麦注射液联合奥沙利铂及奥沙利铂单药对人肠癌Lovo细胞的抑制活性的比较 由表1可以看出，参麦注射液和奥沙利铂对人肠癌Lovo细胞的增值都有抑制作用，但是与单药相比，联合参麦注射液后对肠癌细胞的抑制率增加，加入参麦注射液后能明显提高奥沙利铂对肠癌Lovo细胞的杀伤作用，效果更明显。

表1 参麦注射液和奥沙利铂对Lovo细胞的抑制活性

2.2 参麦注射液联合化疗对肠癌裸鼠移植瘤的抑制作用 由表1可见，先给予参麦再给予化疗药物对肠癌荷瘤裸鼠的抑制作用最大，肿瘤生长延缓，体积较小，奥沙利铂组其次，参麦和化疗药同步及先用化疗药后用参麦效果相差无几。从表2可以看出，参麦及奥沙利铂对于荷瘤裸鼠都有抑瘤作用，而先参麦后给予化疗药物的遗留作用明显强于两者单药或者其他联合用药方式，瘤重抑瘤率差异效果显著(P<0.05)。参麦联合化疗与对照组相比差异有极为显著(P<0.01)。病理观察结果显示，采用参麦联合化疗治疗组中的淋巴细胞浸润、中性粒细胞、肿瘤细胞坏死程度均明显高于对照组，癌细胞团体积，血管反应则明显少于对照组(见图1)。

表2 奥沙利铂、参麦及两者联用对荷瘤裸鼠的抑瘤作用

Lovo细胞在对照组的生长状况，HE×100(A)和HE×400(B),联合组(参麦+奥沙利铂)，更多的组织坏死和淋巴浸润，

3 结 论 参麦注射液组方源于《千金要方》之生脉散，是“生脉散”衍变方，具有益气养阴之功效，参麦是人参和麦冬组成的复方。目前参麦注射液的抗血管生成作用的实验研究层出不穷，但对参麦注射液的使用时间问题的研究几乎没有。本文通过对荷瘤裸鼠模型的抑瘤作用，研究在化疗的不同时间段应用参麦，通过对裸鼠的抑瘤情况及瘤体大小的观察，寻找参麦注射液抗血管生成的最佳治疗时间。本实验研究体外结果表明，参麦联合化疗对人肠癌Lovo细胞及HUVEC的杀伤作用活性最强，明显高于同等剂量化疗药物或单纯用参麦注射液对细胞的杀伤活动。动物实验结果表明，先给予参麦注射液后给予奥沙利铂对肠癌Lovo荷瘤裸鼠皮下移植瘤的抑制作用最大，瘤体体积及重量最小，对肿瘤细胞的增值抑制作用最强，且肿瘤细胞的体积减少最明显，坏死癌细胞量大，癌细胞周围的炎细胞浸润明显。本研究表明给予化疗与参麦注射液联合，可增强抑制肿瘤细胞的能力，联合用药后抑制肿瘤细胞作用增强，起到协同作用，比单给予参麦注射液或化疗效果更强，且先给予参麦后给予化疗效果最佳，可能是参麦注射液的最佳抗血管生成时间。

化学药物治疗成为抑制肿瘤细胞的主要手段之一，化学药物在抑制肿瘤细胞生长的同时对机体免疫系统造成严重的损伤[4]。在治疗肿瘤的过程中，对于肿瘤细胞的杀伤作用及对机体免疫功能的保护具有相同的重要性，因此，我们致力于寻找一种既能增强机体的免疫功能及增强化疗疗效，又能减少化学治疗带来的毒副作用的药物。本研究通过对参麦注射液联合化疗对荷瘤裸鼠的增值已抑制作用，探讨参麦注射液在肿瘤抗血管生成作用以及对化疗药物的增敏作用。研究结果表明参麦注射液化疗前用药可以显著提高疗效，提高患者生活质量及总生存期。化疗前给药可能是参麦注射液的抗血管生成最佳治疗时间，确切机制仍需进一步探讨和研究。

[1] 蒋益兰,荆 珍. 中医药防治大肠癌转移作用和机制的研究概况[J]. 湖南中医杂志, 2009, 25(1)：1376-1379.

[2] 王 程,杨运高,王学良. 活血化瘀经典方剂对小鼠大肠癌肝转移模型端粒酶及p53、cerbB-2、Bcl - 2 基因表达的影响[J]. 第一军医大学学报, 2005, 24(7)：758-760.

[3] 钱晓萍,刘宝瑞,胡 静,等. 参麦注射液联合环磷酰胺抑制血管生成作用的实验研究[J]. 现代肿瘤医学, 2006, 14(11)：1344-1347.

[4] Zhang L, Yu D, Hicklin DJ, et al. Combined anti2fetal liver kinase 1 monoclonal antibody and continuous low2dose Doxorubicin inhibits angiogenesis and growth of human soft tissue sarcoma xenografts by induction of endothelial cell apop tosis[J]. Cancer Res,2012, 62: 2034-2042.

(收稿2015-01-20;修回2015-02-11)

Shen Mai injection combined with chemotherapy in colorectal cancer Lovo cell inhibition

Department of Oncology, Shanghai Meishan Hospital

(Nanjing 210001) Li Jun

Objective: To investigate the SMI was anti-angiogenic effect in tumor time window problem that optimal treatment time. Methods: The tumor-bearing mice were observed Shenmai injection combined with oxaliplatin / fluorouracil inhibit tumor proliferation and survival of tumor-bearing mice outlook affect period. Results: shenmai combination chemotherapy cytotoxicity in human colon cancer cells and HUVEC Lovo most active, significantly higher than the SMI was measured at the same chemotherapy drugs or simply using. Animal experiments show that SMI was first given after the administration of oxaliplatin Lovo cancer tumor-bearing nude mice maximum inhibition, tumor volume and minimum weight, tumor cell killing effect is most obvious, cancer cell volume decrease significantly. Conclusion: The administration of chemotherapy may be shenmai injection of anti-angiogenic best treatment time, the exact mechanism needs further discussion and study.

Colorectal neoplasms/traditional Chinese medicine therapy Shen Mai Zhu She ye/therapeutic uses

* 南京市医药卫生科研项目(YKK10210)

结直肠肿瘤/中医药疗法 参麦注射液/治疗应用

R735.3

A

10.3969/j.issn.1000-7369.2015.05.050