阿托伐他汀钙对动脉粥样硬化兔主动脉TLR2表达的影响

陕西省蒲城县医院(蒲城 715500)

孔令武 潘军强 王 毅 姚晓伟

阿托伐他汀钙对动脉粥样硬化兔主动脉TLR2表达的影响

陕西省蒲城县医院(蒲城 715500)

孔令武 潘军强 王 毅 姚晓伟

目的：探讨阿托伐他汀钙对新西兰大白兔主动脉粥样硬化斑块内TLR2表达的影响及其抗动脉粥样硬化TLR机制。方法: 将新西兰大白兔30只分为高脂饮食加阿托伐他汀钙组、高脂饮食组、正常对照组，喂养8周后处死每组动物取出主动脉，测量动脉粥样硬化病变面积；行免疫组化染色及Western blot检测，观察兔主动脉粥样硬化程度及TLR2蛋白在动脉粥样硬化斑块中的表达。结果:高脂饮食加阿托伐他汀钙组、高脂饮食组动脉粥样硬化斑块面积与动脉内膜面积比值及TLR2蛋白表达均高于正常对照组；高脂饮食加阿托伐他汀钙组动脉粥样硬化斑块面积与动脉内膜面积比值及TLR2蛋白表达均低于高脂饮食组。结论:阿托伐他汀钙可使主动脉粥样斑块内TLR2蛋白表达下调，具有显著抗动脉粥样硬化的作用。

动脉粥样硬化(Atherosclerosis，AS)常累积心、脑、肾等主要器官，致残率及病死率高。脂质代谢异常是动脉硬化最重要的危险因素，其发病机制成为心血领域研究的焦点。众多研究认为AS是一种动脉血管的慢性、非特异性炎症性病变。相关研究显示：Toll 样受体(Toll-like receptors,TLRs) 是一组跨膜受体蛋白质，TLR2是启动炎性反应的促炎因子，TLR2高水平在AS发生、发展中所起促进作用[1]。阿托伐他汀钙作为一种经典的调脂药，除具有降低低密度脂蛋白胆固醇的作用外，还具有“多效性”如：改善血管内皮功能、抗炎、抗氧化等功能[2]。本研究通过观察阿托伐他汀钙对兔主动脉粥样硬化斑块内TLR2蛋白表达的影响，进而探讨了其抗动脉粥样硬化的机制。

材料与方法

1 实验动物及药品 购自西安交通大学实验动物中心新西兰兔30只，雄性，1月龄，体重1.2～1.5kg。在实验室使用普通饲料喂养1周后，称重，随机分为三组：正常对照组、高脂饮食组及高脂饮食加阿托伐他汀钙(国药准字H20051408)组，每组各10只。分别给予正常饲料120g/d、高胆固醇饲料120g/d、高胆固醇饲料120g/d+阿托伐他汀钙10mg/(kg·d)灌胃，喂养8周后处死上述各组动物。

2 方 法

2.1 标本取材及留取：各组实验动物末次给药前12 h禁食，在预定实验终点3%戊巴比妥钠30mg/kg耳缘静脉注射，全身麻醉后立即开胸取出从近主动脉弓部到髂动脉分叉处全部主动脉。所取组织分作两段，一段以4%多聚甲醛液固定用于组织病理学检测,另一段置于- 70℃冰箱用于提取蛋白。

2.2 免疫组化特异性染色镜下观察 ：疫组化法观察新西兰大白兔主动脉斑块内TLR2蛋白表达水平。斑块内TLR2蛋白表达的阳性结果为：血管壁染成棕黄色。用显微镜显像系统采集图像，随机选取血管壁3个视野(×400)，计算机自动测量并计算A值。

2.3 Western blot检测主动脉TLR2蛋白的表达：提取总蛋白并用BCA试剂盒测蛋白总浓度及变性。每孔以50g总蛋白上样后进行SDS-PAGE凝胶电泳，分离蛋白后转膜，加入一抗(1∶250鼠抗兔TLR2单克隆抗体或者1∶1000鼠抗兔β-actin)4℃孵育过夜。TBST浸洗后加入二抗(羊抗鼠IgG，1∶1000稀释)4℃孵育过夜。应用凝胶扫描成像系统中进行扫描分析，以β-actin作为内参。

结 果

1 三组间 AS斑块面积变化 见表1。高脂饮食加阿托伐他汀钙组、高脂饮食组AS斑块面积与动脉内膜面积比值均高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。高脂饮食加阿托伐他汀钙组AS斑块面积与动脉内膜面积比值低于高脂饮食组，差异亦有统计学意义(P<0.05)。

表1 组斑块面积百分比比较

注：与对照组比较，*P<0.05；与高脂饮食组比较，#P<0.05

2 三组间TLR2蛋白特异性染色表达阳性面积比比较 见表2、图1。高脂饮食加阿伐他汀钙组、高脂饮食组血管壁TLR2蛋白表达均高于对照组，差异有统计学意义(P<0.01)；高脂饮食加阿托伐他汀钙组血管壁TLR2蛋白表达高于高脂饮食组，差异有统计学意义(P<0.05)。

表2 各组主动脉血管壁TLR2蛋白表达半定量分析

注：与正常对照组比较，*P<0.05；与高脂饮食组比较，#P<0.05

图1 各组主动脉血管壁TLR2蛋白表达(×400)

3 三组间TLR2蛋白Western blot结果比较 见图2。高脂饮食组、 高脂饮食加阿托伐他汀钙组、对照组TLR2蛋白表达分别为1.415±0./066、0.913±0.087、0.412±0.038。组间比较差异有统计学意义(P<0.05)。

图2 TLR2蛋白Western blot结果

讨 论

研究显示患有动脉粥样硬化症的患者，均处于慢性、亚临床的炎性状态[3-4]，TLR2是启动慢性炎性反应的促进因子。本研究通过高脂饮食及高脂饮食加阿托伐他汀钙建立动脉粥样硬化兔模型，应用免疫组化法和Western-blot技术发现：与对照组相比，各动脉粥样硬化组主动脉组织中TLR2蛋白表达明显上调，提示在动脉粥样硬化的发生、进展过程中，TLR2可能起着重要作用。

有研究报道TLR2促进脂肪在巨噬细胞中积聚，最终导致巨噬细胞转化为泡沫细胞，后者是动脉粥样硬化的标志[5]。TLR2在糖尿病鼠中高表达，易发生高脂饮食诱发的胰岛素抵抗；相反，用高脂饮食喂养老鼠，抑制TLR2功能后，胰岛素敏感性增加，促炎信号转导作用减弱[6-7]。此外，TLR2可通过多种可溶性细胞因子产生生物学效应：活化补体及内皮细胞、增加血管通透性、聚集中性粒细胞。聚集的中性粒细胞则可进一步释放炎症因子、蛋白酶、活性氧等物质直接导致血管内皮损害。内皮细胞受损后又可产生黏附因子，后者进一步招募中性粒细胞，周而复始，形成恶性循环。总之，众多研究都支持TLR2水平高表达促进动脉粥样硬化的发生、发展。

本研究显示，正常新西兰大白兔给予高胆固醇饲料饲养后，可出现明显的主动脉硬化，亦有大量动脉粥样硬化斑块形成。应用免疫组化与Western-blot技术，从组织学与细胞学水平、分子信息水平通过半定量与定量的分子生物学技术发现高脂饮食可使主动脉血管壁TLR2蛋白表达明显上调，给予他汀类调脂药阿托伐他汀钙干预后TLR2蛋白表达可下调。即阿托伐他汀钙在一定程度上使主动脉动脉粥样硬化斑块内TLR2蛋白表达下调。这进一步从分子生物信息学的角度证明TLR2参与了动脉粥样硬化的发生、发展，而阿托伐他汀钙通过下调TLR2蛋白表达发挥抗动脉粥样硬化作用。有关阿托伐他汀钙通过下调TLR2蛋白表达，从而发挥抗动脉粥样硬化作用的精确分子机制有待于进一步研究。

[1] Caricilli AM, Nascimento PH, Pauli JR,etal. Inhibition of toll-like receptor 2 expression improves insulin sensitivity and singnaling in muscle and white adipose tissue of mice fed a high-fat diet[J].Journal of Endocrinology, 2008,199(3):399-406.

[2] Gocmen AY, Ocak GA, Ozbilim G,etal. Effect of atorvastatin on atherosclerotic plaque formation and platelet activation in hypercholesterolemic rats[J]. Can J Pharmacol, 2013,91(9):680-685.

[3] 李永红, 葛志明, 王其新, 等．阿托伐他汀对高胆固醇血症患者血小板血管紧张素Ⅱ受体表达的影响[J]．中华高血压杂志，2008, 16(10):894-898．

[4] Maiti R, Agrawal NK．Atherosclerosis in diadbetes mellitus: role of inflammation[J].Indian Journal of Medical sciences,2007,61(5): 292-306.

[5] 姚晓伟,潘军强,陈海潮,等. 吡咯列酮对兔主动脉粥样硬化程度的影响[J].陕西医学杂志，2013，42(9):1118-1120.

[6] Dasu MR, DevardjS, Park S,etal. Increased toll-like receptor (TLR) activation and TLR ligands in rescently diagnosed type 2 diabetic subjects[J]. Diabetes Care, 2010,33(4):861-868.

[7] Zhang F． Peroxisome proliferator-activated receptor-γ as a therapeutic target for hepatic fibrosis: from bench to bedside[J]． Cell Mol Life Sci,2013,70(6): 259-276．

(收稿：2015-08-03)

@阿托伐他汀钙 动脉粥样硬化/病理生理学 胆固醇/分析 Tou样受体 兔

R392.5

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2015.11.005