人软骨糖蛋白-39在原发性肝癌中的表达以及对TACE术后患者预后的评估价值

徐亚卿，闫胜利，肖 峰

由于原发性肝癌(HCC)患者早期临床症状不典型以及我国当前缺乏有效早期筛查手段，多数患者就诊时已失去手术机会，非手术治疗尤其肝动脉化疗栓塞术(TACE)成为最主要治疗方案。但是，当前缺乏对于TACE 手术疗效的客观、有效、准确的评价指标，且部分患者术后病情进展较为隐匿，临床上难以察觉，给评估预后带来困难，故寻找判断HCC 患者TACE 手术疗效和预后评估指标有重要临床意义。YKL-40 又称人软骨糖蛋白-39(HCpg-39)，是一种壳质酶家族的分泌型糖蛋白，已经证实在宫颈癌、大肠癌、肺癌等多种实体瘤中高表达，主要参与细胞外基质重建以及血管生成，是细胞生长和肿瘤侵袭转移的标记物［1-2］。同样，有研究证实YKL-40 在肝癌组织中高表达，但通过动态监测YKL-40 在TACE 术前后的变化来判断疗效和预后的研究尚未见报道，故我们对此进行了观察研究，现将结果报告如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 为2010年2月－2011年10月我院收治HCC 患者87 例，其中男51 例，女36 例，年龄35～74 岁，平均年龄(57.4 ±11.6)岁。所有患者均符合原发性肝癌诊断共识，并排除转移性肝癌、合并自身免疫性疾病、合并血液系统疾病等可能干扰YKL-40 检测的疾病。其中肿瘤直径≥5 cm者59 例，＜5 cm 者28 例;伴有门静脉癌栓者46 例，无癌栓者41 例。肝功能Child-Pugh 分级:A-B 级者60 例，C-D 级者27例。其中54 例HCC 患者在排除禁忌后行TACE 术治疗。肠系膜上动脉间接门静脉造影及腹腔动脉造影，了解肿瘤大小、数量、血供情况，选择肝固有动脉或肝左、右动脉支插管行栓塞化疗。TACE 采用碘化油5～20 ml，丝裂霉素4～10 mg混合，根据肿瘤的大小决定药物剂量。同时，同期选取25 例健康志愿者作为对照，其中男14 例，女11 例，年龄30～77岁，平均年龄(53.2 ±12.8)岁。

1.2 标本采集 首诊HCC 患者于入院后次晨抽取静脉血5 ml，置于EDTA 抗凝管内，3 000 r/min 高速离心10 min，取上清液1.5 ml，置于－20℃冰箱内保存，每3 个月集中检测1次。上述步骤均于标本收集后30 min 内完成。健康对照人群和TACE 术后1月复测血清样本亦按照上述步骤采集。

1.3 实验检测 采用酶联免疫吸附实验(ELISA)法测定YKL-40，兔抗人YKL-40 多克隆抗体试剂盒购自上海蓝基生物有限公司，所有操作严格按试剂说明书进行。根据标本吸光度绘制标准曲线并转化为YKL-40 浓度。

1.4 随访 对54 例行TACE 术的HCC 患者进行随访，随访资料通过查阅住院病例、电话随访、门诊随访的方式获得。随访时间3～36 个月，从首次行TACE 术当日作为起始，至2015年1月1日终止，其中3 例失访，随访率94.44%。总生存期(OS)为患者首次行TACE 术当日至死亡日的期限;对于随访截止日仍存活的患者，以首次行TACE 术当日至末次随访日之间的期限为准。

1.5 统计学方法 采用Excel 建立数据库，SPSS16.0 统计软件进行处理。YKL-40 浓度符合正态分布，以±s 表示，t 检验比较2 组间差异，计数资料采用χ2检验。生存分析采用Kaplan-Meier 方法，并行LogRank 检验比较生存时间差异;应用Cox 比例风险模型分析预后相关因素。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HCC 患者YKL-40 水平以及与临床病理的相关性 初诊原发性肝癌患者YKL-40 平均水平为(331.4 ±126.8)pg/ml，高于健康人群(184.0 ±83.7)pg/ml，差异具有统计学意义(P＜0.05)。其中肿瘤直径≥5 cm 者YKL-40 平均水平为(352.9 ±131.0)pg/ml，高于肿瘤直径＜5 cm 者(286.1 ±117.7)pg/ml，差异有统计学意义(P＜0.05)。YKL-40 水平升高肿瘤大小有关(P＜0.05)，与性别、年龄、有无癌栓、AFP 水平无关(P＞0.05)。见表1。

表1 YKL－40 与HCC 患者临床病理的相关性

2.2 TACE 术后YKL-40 水平变化以及与预后的关系 本资料87 例HCC 患者中54 例行TACE 术，术后1月后复测YKL-40 平均水平为(271.6 ±84.2)pg/ml 较术前有所降低，但仍高于健康人群(P＜0.05)。根据术后复测YKL-40 水平将其分为术后YKL-40≥331.4 pg/ml 组和术后YKL-40＜331.4 pg/ml 组，随访统计生存时间，Kaplan-Meier 分析显示术后YKL-40≥331.4 pg/ml 组总体生存时间(5.4 ±3.8)月，短于术后YKL-40＜331.4 pg/ml 组(9.7 ±4.4)月。LogRank 检验两组间总体生存率(OS)差异显著，具有统计学意义(P＜0.05)。见图1。

图1 TACE 术后YKL－40 水平与生存时间的关系

2.3 影响TACE 术后HCC 患者预后的因素分析 以性别、年龄、肿瘤大小、有无癌栓、AFP 水平(≥400 ng/ml)，术后YKL-40 水平(≥331.4 pg/ml)因素行COX 风险回归分析，结果显示AFP 水平(≥400 ng/ml)和术后YKL－40 水平均是影响TACE 术后患者预后的独立危险因素(P＜0.05)，但术后YKL－40 升高对预后不良的相对危险度(RR)较AFP 更高(RR =2.02 Vs.1.87)。见表2。

表2 影响TACE 术后HCC 患者预后的多因素分析

3 讨论

YKL-40 又称为人软骨糖蛋白－39，因最早发现于人骨肉瘤细胞株MG63 中大量分泌而得名，是哺乳动物18 糖蛋白家族中的成员之一。其编码基因是Clusterin 肿瘤相关基因，位于染色体1q31－ q32 区域，是具有一段10 个外显子，长约8kb，共7948 个碱基配对的DNA 片段［3］。目前已知，YKL-40可通过促进血管平滑肌细胞迁徙，增加与瘤旁间质的粘附活性，从而帮助肿瘤血管生成和浸润转移，同时可参与肿瘤外基质重建，是构成肿瘤形成、生长微环境的重要因子。同时，YKL-40 可通过激活蛋白激酶、三磷酸激酶信号通道的途径，使调控分裂的蛋白激酶磷酸化，产生瀑布样放大的增殖信号，进而发挥调控细胞增殖作用［4］。

研究显示，YKL-40 在包括肝癌在内的多种恶性肿瘤组织中高表达，可作为一种潜在的新型肿瘤标记物，用于评估肿瘤的发展和预后。如文淑英等人［5］发现，YKL-40 用于卵巢癌早期筛查时敏感性、特异性优于传统肿瘤标记物CA125 和CA199。Tarpgaard 等［6］指出，YKL-40 升高是大肠癌预后不良的独立危险因素，且化疗前YKL-40 高表达人群在应用一线化疗药物时敏感性较差。同样，YKL－40 在HCC 发生发展中亦扮演着重要的角色。张永红等人［7］研究发现，乙型肝炎病毒(HBV)整合的HBx 基因及其编码的HBx protein 通过诱导激活Clusterin 基因，进而上调YKL-40 表达，增加肝癌发生风险、肝癌分化潜能和侵袭活性，而这一特性在siRNA 沉默HBx 基因、下调YKL-40 后得到抑制。种种研究结果表明，监测YKL-40 水平变化对于了解HCC 患者病情进展和判断预后有一定意义，但当前国内外报道极少。

肝动脉化疗栓塞(TACE)术作为中晚期HCC 患者首选治疗方法，技术成熟，可行度广，但能否改善预后、提高总体生存率仍存在一定争议，主要原因是缺乏评估TACE 疗效的客观指标，且未获得准确、可靠的术后监测和评估预后的标记物。

本研究通过对比HCC 患者与健康人群YKL-40 水平后发现，HCC 患者YKL-40 水平明显升高，与Zhu 等人［8］的研究结果一致，进一步证实HCC 患者YKL-40 高表达状态。YKL-40升高与肿瘤大小有关，瘤体直径≥5 cm 者YKL-40 水平较＜5 cm 者显著升高，可能与肿瘤负荷大、瘤体与瘤周组织间基质降解、血管生产、肿瘤细胞粘附活性增加有关，但结果有待于更大样本的研究证实。

本研究中54 例HCC 患者接受TACE 治疗，治疗术后1月后复测YKL-40 水平(271.6 ±84.2)pg/ml，较术前有所降低，但仍高于健康人群(P＜0.05)，其中19 例术后YKL-40 仍高于术前平均水平(331.4 ±126.8)pg/ml。为进一步探讨术后YKL-40 下降组患者预后是否得到改善，我们对所有TACE 术患者进行随访并统计生存时间，Kaplan-Meier 分析显示术后YKL-40 下降组总体生存时间优于术后YKL-40≥331.4 pg/ml组，具有统计学意义(P＜0.05)。再者，COX 分析显示术后YKL-40≥331.4 pg/ml 是影响TACE 术后HCC 患者预后的独立危险因素，且RR 高于AFP。结果表明，TACE 术后了解YKL-40 水平动态变化对于判断预后有重要价值，换个角度说，可以通过检测TACE 术后YKL－40 水平是否下降评估手术是否有效。

［1］Francescone R，Ngernyuang N，Yan W，et al.Tumor-derived murallike cells coordinate with endothelial cells:role of YKL-40 in mural cell-mediated angiogenesis［J］.Oncogene，2014，33(16):2110.

［2］尚 倩，赵淑萍.YKL-40 和VEGF 在上皮性卵巢癌组织中的表达及其临床意义［J］.泰山医学院学报，2014，35(3):171-173.

［3］Rehli M，Krause SW，Andreesen R，et al.Molecular characterization of the gene for human cartilage gp-39 CHI3L1 a member of the chitinase protein family and marker for late stages of macrophage differentiation［J］.Genomics，1997，43(2):221-225.

［4］Ngernyuang N，Francescone RA，Jearanaikoon P，et al.Chitinase 3 like 1 is associated with tumor angiogenesis in cervical cancer［J］.Int J Biochem Cell Biol，2014，51:45-52.

［5］文淑英.血清CA199、CA125 和YKL40 联合检测对卵巢癌的诊断价值［J］.中国医疗前沿，2012，7(12):68-69.

［6］Tarpgaard LS，Guren TK，Glimelius B，et al.Plasma YKL-40 in patients with metastatic colorectal cancer treated with first line oxaliplatin-based regimen with or without cetuximab:result from the nordic VII Study［J］.PLoS One，2014，9(2):87746.

［7］张永红，贺兴鄂，唐晓鹏，等.siRNA 沉默HBx 基因对肝癌细胞YKL40 蛋白表达影响的研究［J］.中国医科大学学报，2010，39(4):241-244.

［8］Zhu CB，Wang C，Chen LL，et al.Serum YKL-40 independently predicts outcome after transcatheter arterial chemoembolization of hepatocellular carcinoma［J］.PLos one，2012，7(9):44648.