禽流感病毒PA-N182与鸡COPD蛋白互作的鉴定

王 巧，李庆贺，刘冉冉，郑麦青，文 杰，赵桂苹

(中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，北京 100193)

禽流感病毒PA-N182与鸡COPD蛋白互作的鉴定

王 巧，李庆贺，刘冉冉，郑麦青，文 杰，赵桂苹*

(中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，北京 100193)

宿主蛋白质广泛参与流感病毒基因组在宿主体内的转录、复制和翻译。病毒蛋白质和宿主蛋白质的互作对于病毒的感染有重要影响。PA-N182是新发现的PA基因的转录形式，关于其宿主互作蛋白质的研究目前尚少。COPD(coatomer protein complex，subunit delta)是负责细胞内新合成蛋白质从内质网向高尔基体转运的基因，COPD基因敲除后细胞内流感病毒滴度降低，表明COPD基因可能参与流感病毒的复制。COPD基因影响流感病毒感染的机制仍未见报道。本研究通过构建PA-N182和COPD过表达载体并共转染细胞，利用免疫共沉淀、Western blot的方法，证实在鸡细胞内H5N1禽流感病毒PA-N182蛋白和COPD蛋白有相互作用，表明COPD对流感病毒感染的影响可能与其和PA-N182蛋白的互作并影响PA-N182蛋白从宿主细胞内质网向高尔基体的转运有着密切的联系。

鸡；禽流感病毒；PA-N182；COPD；蛋白互作；免疫共沉淀

禽流感病毒(avian influenza virus，AIV)属甲型流感病毒，其遗传物质为单股负链RNA。禽流感病毒核酸包括HA(hemagglutinin)、NA(neuraminidase)、PB1(polymerase basic protein 1)、PB2(polymerase basic protein 2)、PA(polymerase acidic protein)、NP(nucleoprotein)、M1(matrix protein 1)和NS1(non-structure protein 1)等8个基因片段[1]。上述基因直接编码或者其编码的蛋白质经剪切或修饰后最多成为17种蛋白质[2-3]。PA和PB1、PB2蛋白组成依赖于RNA的RNA聚合酶复合体，参与流感病毒的复制。PA蛋白具有调控蛋白质稳定性、内切酶活性、RNA帽子结构结合及启动子结合等功能[4]。聚合酶复合体捕获宿主细胞的mRNA后，PA蛋白发挥其核酸内切酶活性切割宿主基因mRNA，用于病毒自身RNA的合成[5]。从不同的位置起始翻译或移码突变，PA基因除编码PA蛋白外还编码PA-X、PA-N155和PA-N182三种蛋白质。PA-N182是从PA基因的第182位核苷酸(第13个AUG)起始翻译的蛋白质产物。通过对11 000余株流感病毒毒株的序列分析发现99.3%的流感病毒毒株都有PA-N182蛋白翻译起始所需要的AUG密码子，不具有PA-N182翻译起始所需AUG位点的流感病毒毒株多为禽类和猪的H9N2毒株[6]。

禽流感病毒自身并不具有复制能力，感染宿主后须借助宿主的细胞系统进行复制。流感病毒的组成蛋白和宿主蛋白质有着广泛的相互作用，这些相互作用对于流感病毒的感染、复制和传播有着极为重要的作用。流感病毒PB1和PB2蛋白和人细胞中的PP6蛋白(protein phosphatase 6)有直接作用，PP6蛋白的敲除导致由细胞核向细胞质输出的病毒核糖核蛋白量减少，病毒复制减缓，病毒滴度降低[7]。TRIM22基因是流感病毒的抗性基因，TRIM22对流感病毒的抗性是通过和流感病毒NP蛋白的互作实现的，TRIM22促使NP蛋白发生泛素化并通过蛋白酶体途径降解病毒的NP蛋白，使流感病毒丧失生物学活性[8]。PA-N182是2013年新发现的PA基因的新翻译形式，其缺失了PA蛋白的N端。PA-N182在鸡细胞内有哪些互作蛋白质及其生物学功能仍知之甚少。

COPD(coatomer protein complex，subunit delta)，又名ARCN1，是Coatomer复合物的组成亚基之一。Coatomer复合物参与细胞内合成的蛋白质从内质网到高尔基体的运输。COPD基因突变的小鼠由于细胞内蛋白质运输的障碍导致毛色变浅，同时伴有运动失调等症状[9]。在多个全基因组RNAi扫描研究中都发现了COPD等Coatomer复合物亚基的表达被抑制后会阻碍流感病毒在细胞内复制，表明COPD是影响流感病毒侵染的重要宿主因子[10]。

在本研究中，作者利用蛋白质免疫沉淀等技术分析了H5N1 AIVPA-N182基因和COPD基因的互作情况。我们在鸡胚胎成纤维细胞系(DF1)中过表达了H5N1 AIV的PA-N182基因和鸡COPD基因，并成功的利用免疫共沉淀技术富集了PA-N182蛋白，Western blot显示PA-N182基因的免疫共沉淀产物可以检测到COPD蛋白的存在，表明H5N1禽流感病毒PA-N182基因在鸡细胞内和COPD基因有相互作用。

1 材料与方法

1.1 细胞、毒株及病毒cDNA的合成

DF1细胞购自中国科学院细胞库。本研究所用H5N1禽流感病毒毒株为A/Chicken/ShanXi/2/2006(H5N1)，毒株RNA由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所惠赠。cDNA反转录参照PrimerScriptTMRT Master Mix试剂盒(TaKaRa，大连)操作说明进行，-20 ℃保存备用。

1.2 引物设计

根据Influenza research database公布的A/Chicken/ShanXi/2/2006(H5N1)的PA-N182基因序列、NCBI上公布的鸡COPD基因(GenBank登录号：NM_001079499.1)序列，利用Oligo6软件设计引物(表1)，引物均包含NheⅠ和BamHⅠ酶切位点。引物由金维智生物科技(苏州)有限公司合成。

表1 引物序列

Table 1 Primer sequences

引物Primer上游序列Upstream(5′⁃3′)下游序列Downstream(5′⁃3′)PA⁃N182CCCAAGCTGGCTAGCGCCACCATGGCCAG⁃TAGGGGTCTATGGGATTTTTGTAGTCGGATCCTTTCAGTGCATGT⁃GTGAGGAAGGACOPDATAGGGAGACCCAAGCTGGCTAGCGCCAC⁃CATGGTGCTGTTGGCGGCAGCTGTGTGGTGGTGGTGGTGGTGGGATCCCAG⁃GATTTCATACTTGTCCACCAGG

1.3 蛋白质表达载体的构建

1.3.1 PCR扩增 根据TransPCR SuperMix(全式金)操作说明进行PCR扩增。PA-N182和COPD基因的引物退火温度都为55 ℃，35个循环。

1.3.2 目的基因与载体连接 双酶切pcDNA3.1-3Flag-C载体和pcDNA3.1-6His-C载体，根据无缝连接试剂盒(Clonesmarter)说明书分别与PCR产物PA-N182和COPD连接，转化大肠杆菌感受态细胞后均匀涂在氨苄琼脂糖平板上培养过夜，挑取单个菌落划线并进行PCR鉴定，选取阳性菌落提取质粒进行双酶切鉴定并测序。

1.3.3 质粒提取 液体LB培养基培养转化后的阳性单菌落12 h后，12 000 r·min-1离心15 min收集菌液，根据EndoFree®Plasmid Maxi Kit(Qiagen)说明书操作步骤提取质粒并测定浓度。

1.4 细胞培养及转染

DF1细胞用含10%胎牛血清(Life Technologies)的DMEM高糖培养基(Hyclone)在37 ℃、5%CO2的条件下培养，细胞培养至80%汇合度时转染。细胞转染按Lipofectamine®3000试剂(Life Technologies)说明书进行，用Opti-MEM®培养基稀释Lipofectamine®3000试剂并充分混匀，用Opti-MEM®培养基稀释DNA制成DNA预混液，在DNA预混液中添加P3000TM试剂，在每管已稀释的Lipofectamine®3000试剂中加入稀释的DNA(1∶1比例)，室温孵育5 min，加入DNA-脂质体复合物至细胞中。转染48 h后倒掉旧培养基，PBS冲洗后加0.25%的胰蛋白酶(Hyclone)于37 ℃培养箱消化5 min，轻晃培养皿显微镜下见细胞游离时立即加入2倍体积完全培养基终止消化。将细胞悬浮液加入到15 mL离心管中，1 000 r·min-1、离心5 min，去上清，用PBS重悬细胞并转入1.5 mL离心管中，1 000 r·min-1、离心5 min，去上清，细胞沉淀用于下游试验。

1.5 蛋白质提取

向细胞中加RIPA裂解液并吹匀，置冰上30 min，每5 min轻弹一次离心管。13 000 r·min-1离心10 min，将上清转入新的离心管后根据BCA蛋白质定量试剂盒(Thermo scientific，美国)测蛋白质浓度。

1.6 蛋白质免疫沉淀

裂解液中加入预处理过的Protein G beads(Millipore)20 μL，于4 ℃摇床缓慢振荡2 h，以去除非特异性杂蛋白质，降低背景，离心后收集上清于新离心管中。取1/50裂解液(全蛋白质)保存至-80 ℃冰箱用作阳性对照(Input)，剩余裂解液用作免疫沉淀(IP)即试验组。向用作IP的裂解液中加入anti-FLAG M2 beads(Sigma)，于4 ℃摇床缓慢振荡过夜。离心收集琼脂糖珠，弃上清，RIPA buffer清洗4次，54K buffer清洗2次后加入上样缓冲液，96 ℃煮沸10 min，立即置于冰上，简短离心后吸取上清进行聚丙烯酰胺凝胶电泳。试验以鼠IgG作为阴性对照。

1.7 Western blot

蛋白经聚丙烯酰胺凝胶电泳后转至PVDF膜(Millipore)上，转膜条件为350 mA恒流40 min。PVDF膜分别用相应抗体孵育1 h后显影。本试验所用抗体如下：抗Flag标签抗体-HRP(Cell Signaling Technology)和抗His标签抗体-HRP(Abcam)。

1.8 PA-N182与COPD蛋白互作鉴定的试验分组方法

将PA-N182和COPD表达载体共转染DF1细胞，同时设置Flag空载体、His空载体、Flag空载体和His空载体、Flag空载体和COPD、PA-N182和His空载体5个对照组。

2 结 果

2.1PA-N182及COPD基因表达载体的构建

以H5N1禽流感cDNA和鸡肌肉组织cDNA分别扩增PA-N182和COPD基因，所得的PCR产物大小均符合预期(图1)。PCR扩增所得目的片段用无缝连接试剂盒连入pcDNA3.1-C-Flag载体。转化后所得阳性质粒双酶切结果如图2所示。COPD基因经PCR扩增后连入pcDNA3.1-C-His载体，其阳性质粒双酶切结果如图3所示。PA-N182和COPD载体插入片段均经测序验证无误。上述载体将分别表达带有Flag标签的PA-N182蛋白和带有His标签的COPD蛋白。

图1 PA-N182和COPD PCR产物凝胶电泳Fig.1 Gel electrophoresis results of PCR products of PA-N182 and COPD

所用内切酶为NheⅠ和BamHⅠ。除载体外切出2条目的条带是因为PA-N182序列内部有NheⅠ酶切位点NheⅠ and BamHⅠ enzyme were used.Two target bands were observed because of NheⅠ site in PA-N182 sequence图2 PA-N182表达载体双酶切鉴定Fig.2 Enzyme digestion results of PA-N182 expression vector

图3 COPD表达载体的NheⅠ和BamHⅠ双酶切鉴定Fig.3 NheⅠ and BamHⅠ enzyme digestion results of COPD expression vector

2.2PA-N182基因在DF1细胞的过表达及免疫共沉淀捕获

将PA-N182表达载体转染进DF1细胞中，对照组并没有检测到目的蛋白质，而试验组有PA-N182条带，表明PA-N182正常表达(图4)。以带有Flag抗体的微珠和细胞裂解液孵育进行免疫共沉淀反应，所得产物用Flag抗体进行检测，结果显示，Input阳性对照组和IP组都检测到PA-N182蛋白，而IgG对照组则没有检测到PA-N182的表达(图5)，表明成功且特异地捕获了PA-N182蛋白。

PA-N182表达质粒转染后的DF1细胞提取蛋白质后，取10 μg蛋白质进行Western blot。ACTB作为内参10 μg total protein was used for Western blot，and ACTB was used as loading control图4 转染细胞后PA-N182表达的Western blot检测Fig.4 Western blot detection of PA-N182 in transfected DF1 cells

PA-N182表达质粒转染后的DF1细胞提取蛋白质后，以500 ng总蛋白质进行免疫共沉淀，所得蛋白质进行Western blot。10 μg总蛋白质用作Input。鼠IgG用于免疫共沉淀的阴性对照500 ng total protein was used for immunoprecipitation and protein pulled down by flag beads was used for Western blot analysis.10 μg total protein was used as Input.Mouse normal IgG was used as negative control for immunoprecipitation图5 PA-N182的免疫共沉淀检测Fig.5 Immunoprecipitation of PA-N182 in transfected DF1 cells

2.3 PA-N182与COPD蛋白互作的鉴定

试验组PA-N182和COPD表达载体共转染DF1细胞，对照组Flag空载体、His空载体、Flag空载体和His空载体、Flag空载体和COPD、PA-N182和His空载体，于转染48 h收集细胞并提取蛋白质。以带有Flag抗体的微珠和上述6组样品的细胞裂解液孵育后分别进行免疫共沉淀反应，所得的蛋白复合物分别用Flag和His标签的抗体进行Western blot检测。所得结果如图6所示。用Flag抗体进行的Western blot检测结果中，在Input阳性对照结果中PA-N182和His空载体、PA-N182和COPD共转染组中检测到了PA-N182的表达，表明共转染后PA-N182质粒在DF1细胞中有明确的表达，而在IP组样品中PA-N182和His空载体、PA-N182和COPD两个共转染组的Western blot显示有清晰的PA-N182条带，表明带Flag标签的PA-N182蛋白被成功捕获。

图6 禽流感病毒PA-N182与鸡COPD基因的蛋白质互作Fig.6 Protein interaction between PA-N182 and chicken COPD

用His抗体进行的Western blot检测结果中，在Input阳性对照结果中检测到PA-N182和COPD、Flag空载体和COPD两个共转染组有COPD的表达，表明带有His标签的COPD表达载体表达正常。仅在PA-N182和COPD共转染组的IP产物中检测到COPD蛋白的存在，此结果表明在鸡DF1细胞内，COPD和H5N1禽流感病毒的PA-N182蛋白有相互作用。

3 讨 论

流感病毒自身并不具有复制能力，病毒的复制须借助宿主的细胞系统。流感病毒侵入细胞后，病毒基因组进入宿主细胞核，利用宿主细胞系统完成病毒基因组的转录和复制后进入细胞质利用宿主蛋白质翻译机制完成蛋白质翻译，随后形成病毒核糖核蛋白体(vRNP)，再在宿主细胞内完成病毒的包装和组装后形成新的病毒粒子并释放出细胞[11]。和病毒蛋白质有相互作用的宿主蛋白质对于病毒的感染和复制具有至关重要的影响。禽流感病毒在感染过程中与宿主细胞的多个信号通路及蛋白质有相互联系，如NF-κB信号通路、PI3K/Akt信号通路、MAPK信号通路和TLR/RIG-I信号通路等[12]。

本研究在体外共表达了禽流感病毒PA-N182和鸡COPD蛋白，利用亲和纯化、Western blot技术检测了禽流感病毒PA-N182蛋白和鸡COPD蛋白的互作情况，在鸡胚胎成纤维细胞中证实了PA-N182和COPD的相互作用。真核细胞的大部分肽段在内质网的核糖体上由mRNA翻译而成，肽段在内质网上经过进一步加工形成较成熟的蛋白质，随后蛋白质被转运至高尔基体进行相应的修饰后成为成熟的蛋白质。COPD是Coatomer复合物的组成亚基，Coatomer复合物参与细胞内合成的蛋白从内质网到高尔基体的运输[13]。研究证实对COPD基因进行RNA干扰后的细胞被流感病毒侵染后，细胞内的病毒滴度降低，表明了COPD基因在流感病毒复制过程中的积极作用[10]。COPD基因可能参与流感病毒蛋白在宿主细胞内翻译后从内质网到高尔基体的转运，这一过程被阻断后可能会影响病毒蛋白质翻译后向高尔基体的转运、病毒蛋白质的翻译后修饰及病毒蛋白质的形成，进而抑制病毒的复制。

本研究证实了H5N1禽流感病毒PA-N182和鸡COPD蛋白在细胞内有相互作用，表明病毒PA-N182可能是COPD所转运的蛋白之一。N端缺失的PA-N182并不具备PA基因所具有的RNA聚合酶活性，PA-N182可能并不参与病毒基因的转录而仅和病毒蛋白的复制有关。PA-N182在宿主体内的正常翻译和转运与COPD基因密切相关。COPD对流感病毒侵染的影响可能通过其和PA-N182蛋白的互作及影响PA-N182蛋白的转运实现。PA-N182是新发现的PA基因的N端缺失形式，对于其功能的研究报道较少，本研究揭示了PA-N182和COPD的互作，为揭示PA-N182蛋白的功能提供了新的线索。

[1] SCHRAUWEN E J，DE GRAAF M，HERFST S，et al.Determinants of virulence of influenza A virus[J].EurJClinMicrobiolInfectDis，2014，33(4)：479-490.

[2] JAGGER B W，WISE H M，KASH J C，et al.An overlapping protein-coding region in influenza A virus segment 3 modulates the host response[J].Science，2012，337(6091)：199-204.

[3] SHI M，JAGGER B W，WISE H M，et al.Evolutionary conservation of the PA-X open reading frame in segment 3 of influenza A virus[J].JVirol，2012，86(22)：12411-12413.

[4] SONG J，FENG H，XU J，et al.The PA protein directly contributes to the virulence of H5N1 avian influenza viruses in domestic ducks[J].JVirol，2011，85(5)：2180-2188.

[5] YUAN P，BARTLAM M，LOU Z，et al.Crystal structure of an avian influenza polymerase PA(N) reveals an endonuclease active site[J].Nature，2009，458(7240)：909-913.

[6] MURAMOTO Y，NODA T，KAWAKAMI E，et al.Identification of novel influenza A virus proteins translated from PA mRNA[J].JVirol，2013，87(5)：2455-2462.

[7] YORK A，HUTCHINSON E C，FODOR E.Interactome analysis of the influenza A virus transcription/replication machinery identifies protein phosphatase 6 as a cellular factor required for efficient virus replication[J].JVirol，2014，88(22)：13284-13299.

[8] DI PIETRO A，KAJASTE-RUDNITSKI A，OTEIZA A，et al.TRIM22 inhibits influenza A virus infection by targeting the viral nucleoprotein for degradation[J].JVirol，2013，87(8)：4523-4533.

[9] XU X，KEDLAYA R，HIGUCHI H，et al.Mutation in archain 1，a subunit of COPI coatomer complex，causes diluted coat color and Purkinje cell degeneration[J].PLoSGenet，2010，6(5)：e1000956.

[10] KÖNIG R，STERTZ S，ZHOU Y，et al.Human host factors required for influenza virus replication[J].Nature，2010，463(7282)：813-817.

[11] SHI Y，WU Y，ZHANG W，et al.Enabling the ‘host jump’：structural determinants of receptor-binding specificity in influenza A viruses[J].NatRevMicrobiol，2014，12(12)：822-831.

[12] PFEFFERLE S，SCHÖPF J，KÖGL M，et al.The SARS-coronavirus-host interactome：identification of cyclophilins as target for pan-coronavirus inhibitors[J].PLoSPathog，2011，7(10)：e1002331.

[13] GALAN J A，PARIS L L，ZHANG H J，et al.Proteomic studies of Syk-interacting proteins using a novel amine-specific isotope tag and GFP nanotrap[J].JAmSocMassSpectrom，2011，22(2)：319-328.

(编辑 白永平)

Identification of the Interaction of Avian Influenza Virus PA-N182 and COPD Protein of Chicken

WANG Qiao，LI Qing-he，LIU Ran-ran，ZHENG Mai-qing，WEN Jie，ZHAO Gui-ping*

(InstituteofAnimalScience，ChineseAcademyofAgriculturalSciences，Beijing100193，China)

Host fators are widely involved in transcription，duplication and translation of influenza virus genome，and host factors are reruired for the infection of influenza virus.PA-N182 is a recently identified trunctated form of influenzaPAgene，and little is known about its host interaction factors.COPD(coatomer protein complex，subunit delta)，with the function of translocation of newly translated peptides from endoplasmic reticulum to Golgi apparatus，has an essential role in duplication of influenza virus and its knock down results in decrease of virus titer.We co-transfected PA-N182 and COPD expression vectors into chicken DF1 cells and found that PA-N182 interacted with COPD by the method of immunoprecipitation and Western blot.Our results reveal that COPD might affect the infection of influenza virus through ineracting with PA-N182 and translating it from endoplasmic reticulum to Golgi apparatus.

chicken；avian influenza virus；PA-N182；COPD；protein interaction；immunoprecipitation

10.11843/j.issn.0366-6964.2015.10.025

2015-01-21

中国农业科学院科技创新工程(ASTIP-IAS04)；国家科技支撑项目(2011BAD28B03)；国家肉鸡产业技术体系(CARS-42)

王 巧(1991-)，女，山东日照人，硕士生，主要从事家禽抗病育种研究，E-mail：17746516692@163.com

*通信作者：赵桂苹，研究员，E-mail：zhaoguiping@caas.cn

S813.1；S858.315.3

A

0366-6964(2015)10-1899-06