正交试验法优化海洋星虫多糖碱提法提取工艺*

刘玉明，钱甜甜，蒋定文，何 颖，沈先荣，李珂娴，陈 伟，侯登勇，刘 琼，王庆蓉，罗 群，江叔奇

（1.中国人民解放军海军医学研究所，上海 200433； 2.浙江中医药大学，浙江 杭州 310053）

正交试验法优化海洋星虫多糖碱提法提取工艺*

刘玉明1，钱甜甜1，蒋定文1，何 颖1，沈先荣1，李珂娴1，陈 伟1，侯登勇1，刘 琼1，王庆蓉1，罗 群1，江叔奇2

（1.中国人民解放军海军医学研究所，上海 200433； 2.浙江中医药大学，浙江 杭州 310053）

目的 优选海洋星虫多糖的提取工艺。方法 以料液比、NaOH浓度、提取温度、提取时间为考察因素，以多糖含量与多糖得率的乘积为评价指标，采用正交试验法优选海洋星虫多糖的提取工艺。结果 海洋星虫多糖的最佳工艺条件为料液比1∶4，NaOH浓度为1%，温度60℃，时间4 h。结论 该提取工艺简便、快捷，可用于海洋星虫多糖的提取。

海洋星虫多糖；提取工艺；正交设计

海洋星虫 Sipunculusnudus Linnaeu.俗称沙虫、海蚕沙、海蚕、沙肠子、海肠子、星虫，是星虫动物门方格星虫目方格星虫科方格星虫属裸体方格星虫的全体，资源丰富，在我国沿海北至渤海湾南至北部湾以及海南、台湾等地均有分布。海洋星虫的保健功能在我国古代医药专著中多有记载，著名本草学家李时珍的《本草纲目》中记载有“海蚕”的药用功效。中医认为，海洋星虫性味甘、咸、寒，具清肺补虚、滋阴降火功效，临床用于骨蒸潮热、阴虚盗汗、肺虚咳喘、胸闷痰多等疾病，著名本草学家李荀的《海药本草》中记载：“海蚕沙味咸，大温，无毒。主虚劳冷气，褚风不遂。久服令人光泽，补虚羸，轻身，延年不老。”海洋星虫含有丰富的多糖、蛋白质、微量元素等多种活性物质［1］，前期药效学研究结果表明，海洋星虫多糖在提高免疫［2］、抗疲劳［3］、促智［4］等方面有显著作用。为了进一步深入研究海洋星虫提取物中多糖的药理作用，本研究中采用正交试验设计法对海洋星虫多糖的提取工艺进行优化，并对其多糖含量和得率进行了测定，旨在为进一步最大限度地利用星虫的有效成分奠定基础，也为海洋星虫多糖的新药申报提供实验室依据。

1 仪器与试药

高速组织捣碎仪（上海精科实业有限公司）；HetoLyolab 3000型冷冻干燥机；循环水式多用真空泵SHB－ⅢA（上海预康科教仪器设备有限公司）；全不锈钢电动多用绞切机（江苏省丹徒县民用设备厂）；旋转蒸发器（上海申胜生物技术有限公司）；85－2型恒温磁力搅拌器（上海司乐仪器厂）；SJ3200型超声波清洗机（上海洁净超声波设备厂）；胶体磨型廊坊通用机械厂；电热恒温水浴锅（上海医疗器械五厂）；GL－21M型离心机（上海市离心机械研究所）。葡萄糖（AR级，上海化学试剂分装厂，批号为0690404；蒽酮（批号为20080618），氢氧化钠（批号为F20080921），盐酸（批号为T050704），浓硫酸（均为AR级，中国医药集团上海化学试剂公司产品；批号为 20020412）；三氯乙酸（进口分装，批号为LJ0810B508J）；95%医用乙醇（上海胜德化工有限公司，批号为F20080921）。新鲜海洋星虫购自广西北海，由上海海洋大学水产与生命学院进行药材鉴定。

2 方法与结果

2.1 海洋星虫多糖的提取

分别称取海洋星虫原料50 g，浸泡过夜，清洗，先用大型剪切机切碎（重复2次），分别按照设定好的料液比、NaoH浓度、提取温度、提取时间进行提取，以9 000 r／min的速率离心30 min，弃去沉淀，得上清液。将各上清液调pH至7.0，搅拌下加三氯乙酸至pH＝4，以9 000 r／min的速率离心30 min，得上清液。上清液加入95%医用乙醇，使乙醇终浓度为75%，4℃静置12 h，9 000 r／min的速率离心30 min，取沉淀，用75%医用乙醇洗涤沉淀3次，干燥，得海洋星虫多糖。

2.2 多糖含量测定方法的建立［5］

溶液制备：精密称取105℃干燥至恒重的葡萄糖对照品50 mg，置500 mL容量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，即得对照品溶液。分别取拟订工艺制备的海洋星虫多糖20 mg，置100 mL容量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，即得供试品溶液。

标准曲线制备：分别精密吸取对照品溶液0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2 mL，置10 mL具塞试管中，加水至2.0 mL，精密加入硫酸－蒽酮溶液6 mL，摇匀，置水浴中加热15 min，取出，放入冰浴中冷却15 min，以相应的试剂为空白，照紫外－可见分光光度法，在625 nm波长处测定吸光度，以吸光度为纵坐标、质量，浓度为横坐标。得标准曲线，回归方程为 Y＝50.576 X＋0.0281，R2＝0.9967（n＝6）。结果表明，用0.1%硫酸－蒽酮溶液显色后，葡萄糖质量浓度在0.02～1.2 g／L范围内与吸光度呈良好线性关系。

测定法：精密称取所制备的多糖提取物各3份，每份20 mg，分别置100 mL容量瓶中，加水使溶解，摇匀，精密量取0.4 mL溶液，置10 mL具塞试管中，照标准曲线制备项下方法，同法操作，依法测定吸光度，并从标准曲线上计算供试品溶液中多糖含量。2.3 海洋星虫固体得率测定

取各提取工艺条件下所制备的海洋星虫多糖提取物，置烘箱中105℃烘5 h，移至干燥器中，冷却30 min，精密称定质量，再在105℃干燥1 h，冷却，称重，至恒重，计算总固体得率。

2.4 正交试验优化提取工艺

试验设计：称取星虫原料50 g，共9份，编号，泡水过夜，洗净，切碎，组织匀浆。以干浸膏得率和多糖含量为考察指标，考察料液比（因素A）、NaOH浓度（因素B）、提取温度（因素C）、提取时间（因素D）对提取工艺的影响，并对提取工艺进行优选，从而确定碱提法最佳提取工艺。采用 L9（34）正交表进行试验，试验因素与水平见表1，最终得9份海洋星虫多糖。

表1 正交试验因素水平

结果：分别对正交试验所得的9份样品，按照2.2及2.3项下方法进行含量测定和得率计算，并以含量与得率的乘积为评价指标。结果见表2。

统计分析：以多糖含量与得率的乘积为评价指标，分别对正交试验结果分析，其直观分析表见表2，方差分析见表3。根据正交试验方差分析结果，影响星虫多糖产率因素的大小顺序是B＞A＞D＞C，即NaOH浓度＞料液比＞时间＞温度。直观分析，提取星虫粗多糖的最佳工艺条件为A2B3C3D3，即料液比1：4、NaOH浓度1%、温度60℃、时间4 h。

2.5 星虫多糖中试生产验证试验

为了进一步验证上述工艺，分3次对星虫多糖进行批量提取，并对提取物进行多糖含量和得率计算。

分别称取海洋星虫原料3份，浸泡过夜，清洗，先用大型剪切机切碎（重复2次），加入4倍量水在胶体磨匀浆，加入1% NaOH，60℃提取4 h，以9 000 r／min的速率离心30 min，弃去沉淀，得上清液。将各上清液调pH至7.0，搅拌下加三氯乙酸至pH＝4，以9 000 r／min的速率离心30 min，得上清液。上清液加入95%医用乙醇使乙醇终浓度为75%，4℃静置12 h，以9 000 r／min的速率离心30 min，取沉淀，用75%医用乙醇洗涤沉淀3次，干燥，得海洋星虫多糖。对粗多糖进行含量测定和得率计算，结果见表4。可见，优选工艺提取简单、可行、重复性好，符合实际生产要求。

3 讨论

海洋星虫主要栖息于沿海潮间带滩涂区以及浅海泥沙质或沙质海底，以低潮处最多，呈穴居，在我国具有广泛的自然资源，并具有广泛的应用保健价值，在民间素有“动物人参”“海洋里的冬虫夏草”的美誉。因此，如何有效地对海洋星虫多糖进行提取和制备，对于海洋星虫的深入开发具有重要意义。

表2 正交试验结果

表3 正交试验方差分析表

动物多糖有多种提取方法，如热水浸提法、碱浸提法以及酶解提取法，本研究中通过正交设计法优化出海洋星虫多糖碱提法的最佳提取工艺。碱溶液的浓度和提取温度对多糖的结构和提取效率具有重要的影响，在提取过程中应尽量控制NaOH浓度和提取温度，以免破坏其结构。

［1］刘玉明，钱甜甜，何 颖，等.方格星虫多糖不同提取工艺的比较研究［J］.时诊国药国药，2011，22（6）：1 454－1 455.

［2］李珂娴，沈先荣，何 颖，等.方格星虫多糖对小鼠免疫功能的影响［J］.中国海洋药物，2012，31（1）：46－49.

［3］刘玉明，钱甜甜，莫琳芳，等.方格星虫多糖对运动小鼠抗疲劳实验研究［J］.中国海洋药物，2012，31（3）：42－44.

［4］何 颖，沈先荣，蒋定文，等.方格星虫多糖对记忆障碍小鼠学习记忆能力的影响［J］.中国海洋药物，2012，31（1）：38－42.

［5］国家药典委员会.中华人民共和国药典（一部）［M］.北京：化学工业出版社，2005：130.

Optimization of Alkali Extraction Method of Sipunculusnudus Polysaccharide by Orthogonal Experiment

Liu Yuming1，Qian Tiantian1，Jiang Dingwen1，He Ying1，Shen Xianrong1，Li Kexian1，Chen Wei1，Hou Dengyong1，Liu Qiong1，Wang Qingrong1，Luo Qun1，Jiang Shuqi2

ObjectiveTo optimize the extraction technology of polysaccharide from Sipunculusnudus Linnaeu.MethodsThe extraction technology of the sipunculusnudus polysaccharide was optimized by the orthogonal design with the solid－liquid ratio，sodium hydroxide concentration，extraction temperature and extraction time as the investigation factors and the product of the polysaccharide content and the polysaccharide yield as the evaluation index.ResultsThe optimal extraction technology of the sipunculusnudus polysaccharide was as follows：the solid－liquid ratio was 1∶4，the concentration of sodium hydroxide was 1%，the extraction temperature was 60℃ and the extraction time was 4 h.ConclusionThis extraction technology is simple and rapid，which can be applicable for the extraction of the sipunculusnudus polysaccharide.

Sipunculusnudus polysaccharide；extraction technology；orthogonal design

表4 批量生产验证试验结果

TQ461；R284.1；R282.77

A

1006－4931（2015）02－0021－02

刘玉明，博士研究生，副研究员，主要从事药物核辐射防护及中药现代化研究工作，（电话）021－81883886；沈先荣，博士研究生，研究员，主要从事海洋药物在核辐射损伤和核事故应急中的防护研究工作，本文通讯作者，（电话）021－81883871。

2014－07－28）

*国家科技重大专项新药创制项目，项目编号：2008ZXJ09004－027。

（1.Naval Medical Research Institute，Shanghai，China 200433；2.Zhejiang Chinese Medicine University，Hangzhou，Zhejiang，China 310053）