微小RNA治疗从实验室到临床需突破的瓶颈限制

DOI: 10. 3969/j.issn.1672-8521.2015.02.017

基金项目：国家“973”计划资助项目（2012CB518105）；国家自然科学基金资助项目（81121004，81230041，81171798）

通讯作者：张翠萍（E-mail:zcp666666@sohu.com）；付小兵（E-mail:fuxiaobing@vip.sina.com）

微小RNA（miRNA）是由18 ～24个核苷酸组成的单链非编码小RNA。研究预测，人类基因组中超过60%的基因受miRNAs调节, miRNAs在各种生理、病理过程和疾病治疗中发挥着重要作用 [1-2]。作为分子生物领域一个新的研究热点，当前miRNAs的研究发展迅速，获得了重要的研究进展，但miRNA研究仍处于早期阶段，尤其面向临床应用时，许多现实问题和技术性瓶颈仍有待于解决。著名的国际制药公司罗氏公司（Roche）取消了其RNA干扰研究项目，由此可看出，miRNA治疗从实验室到临床的道路上还有许多现实困难有待突破。本文主要综述miRNA治疗在临床应用时遇到的现实困难，可能是今后miRNA研究需突破的主要方向。

1　miRNA成为当前研究热点

与双链小干扰RNA（siRNA）相比，miRNA是内源性的，而siRNA是直接合成或通过Dicer酶由双链RNA分解而成。miRNAs通过与靶基因信使RNA（mRNA）非完全配对（部分互补），抑制多个靶基因mRNA的翻译，从而同时减少多个靶基因表达的蛋白产物；而siRNAs只与序列与其高度互补的靶基因mRNA进行配对，导致特异性靶mRNA的裂解或降解。因此，siRNAs具有高效和靶点特异性高的特征；而miRNAs表现出温和而广泛（同时作用于多个靶点）的抑制效应，这可能与疾病发生过程中众多生物分子的复杂改变有关。

1993年，Ambros和Ruvkun首次发现由lin-4基因转录的非编码小RNA能反向调节LIN-14蛋白的表达 [3-4]。随后miRNAs作为疾病特异性的分子标志和治疗靶点逐渐被揭示。在生理研究方面，miRNAs调控细胞自我更新和分化、细胞增殖、细胞凋亡、生物发育、衰老等过程的复杂分子机制正被阐明 [5-6]；在临床诊断方面，疾病特异性miRNAs可由miRNA芯片检测、RNA 印迹法（northern blotting）以及实时定量逆转录-聚合酶链反应（qRTPCR）等手段检测，显著变化的疾病特异性miRNAs可作为疾病诊断和预后评价的生物检测标志。在疾病治疗方面，随着miRNAs在癌症、病毒感染、免疫疾病和心血管疾病过程中的治疗作用和调节机制的揭示，miRNAs作为一类新的治疗因子，已成为当今最具价值和潜力的药物作用新靶点之一。例如，化学合成的miRNA(miR)-145通过靶向胰岛素受体底物-1在体外成功地抑制了结肠癌细胞的生长 [7]；miR-451模拟物作为肿瘤抑制剂，减弱了人胶质瘤的扩散能力，加速了胶质瘤细胞的凋亡 [8]。虽然miRNAs用于临床治疗有着美好的前景，但现阶段的相关研究中还有很多问题需要解决。

2　miRNA在实验室研究中存在的问题

2.1　miRNA制备过程中数量和质量的不稳定性　目前，提取RNA的方法主要为Trizol/TRI试剂法和硅/玻璃纤维过滤法。其中，Trizol/TRI试剂提取法最常用。在miRNA制备和储存过程中，miRNA的不稳定性导致基于miRNA的实验结果的可重复性难以保证，直接影响到实验结果真实性。有研究证实，RNA样品中的miRNA和cDNA衍生物具有高度不稳定性，在–80 ℃保存几天后逐渐降解 [9]。相同部位的组织，采样方法不同，组织保存方法不同，所提取的RNA质量也完全不同 [10]。为了使RNA提取尽量标准化，必须做到：采用Trizol/TRI试剂提取，避免基因组DNA的污染；确保提取过程中无RNA酶污染（包括使用无酶的液体、容器、枪头、手套等），避免miRNA降解。

2.2　辨别miRNA靶点和验证miRNA生物功能的复杂性

miRNA的靶点验证和生物功能学识别是miRNA在实验室研究中的限速步骤。某种疾病表型的miRNA表达谱的改变，以及与之相应的转录子和蛋白的变化，可分别通过miRNA表达谱芯片检测、全转录组表达谱分析和蛋白质组质谱分析来确定。然而，这些检测手段有其局限性。通常miRNA芯片能检测出几十至几百个差异显著的miRNAs,而每个miRNA可预测出成百上千个可能作用的靶基因，这使得miRNA下游靶点和功能的验证任务巨大，系统验证难以实现 [11]。靶点预测软件如miRanda、TargetScan、PicTar等均是基于Watson-Crick碱基配对原理进行序列匹配，因此预测结果只具有序列特异性，并不具有基因特异性，不能说明其具有实际的基因功能。并且，生物信息学辅助的靶点预测，只能预测出全mRNA表达谱检测到的显著差异靶点中的50%，因而丢失了部分真阳性的功能性靶点，包含了部分假阳性的非功能性靶点。

其次，评价特定表型的组织器官中miRNA发挥的生物功能是更为复杂的事情。每个特定功能都由一系列分子的调节决定，而每个分子的表达受多个miRNA的调节，并且除miRNA调节外，还受基因突变修饰、甲基化 [12]等其他转录和转录后水平的调节，即使是同一miRNA进行干预，体内和体外miRNA表达谱的变化也不一样，这些使得miRNA生物功能的研究十分困难。

3　miRNA治疗在临床应用中面临的新挑战

3.1　miRNA制剂的传递和传递载体　实现miRNA治疗的前提条件是安全有效地传递miRNA制剂。miRNA传递必须通过系列天然的生理屏障。首先，需避免免疫细胞吞噬、内切核酸酶降解、血清蛋白结合和肾脏过滤（过滤分子质量<50 kDa的粒子），穿过血液循环到达靶组织血液中；其次，它们必须通过血管内皮外溢至靶组织（>5 nm的粒子不能穿过血管内皮）；最后，它们必须穿过细胞膜进入靶细胞，通过胞内体最终释放至胞浆 [13-14]。

目前，miRNA传递系统主要包括化学合成的单链miRNA 抑制剂和双链miRNA 模拟物、miRNA“海绵”和“诱饵”（多个miRNA的串联）、脂质体、纳米粒传递和miRNA病毒载体传递 [15]。

化学合成的miRNA 抑制剂和模拟物,成本低，特异性好，但是由于它具有强亲水性、带负电荷等一系列理化特性，使得穿透细胞膜的能力差，因而吸收率低；并且由于体内内源性核酸酶的降解和肾脏的瞬间清除，体内浓度不稳定，血浆半衰期短，使用时所需剂量较大，使得临床应用受到限制。

脂质体和纳米粒传递是最有临床应用潜力的两种miRNA传递载体。通过脂质体和细胞膜的融合，脂质体包裹的miRNA能有效地释放进入细胞，同时脂质体的包裹可保护寡核苷酸免受内源性核酸酶的降解，提高其稳定性。然而，据报道阳离子脂质体具有高度免疫原性，能引起机体强烈的免疫反应。直径50～70 nm的纳米粒传递系统，例如聚乙二醇（PEG）包裹的阳离子脂双层、聚乙烯亚胺（PEI）-miRNA复合物、端胶原-miRNA复合物、多乳酸共交酯（PLGA）纳米粒，能显著降低miRNA制剂的免疫原性，提高生物兼容性，同时增强miRNA稳定性，避免降解，甚至达到缓释、控释的效果 [16-18]。同时，纳米粒传递系统还为疾病的靶向治疗提供了可能。研究表明，肿瘤靶向性单链Fv片段（scFv）修饰的纳米粒传递系统，能使siRNAs和miR-34a直接靶向肺癌细胞 [19]；携带磁芯的纳米粒传递后，通过磁力操控可实现特定部位靶向治疗 [20]。然而，纳米粒传递系统的最大弊端是其用药后药物在体内停留短暂，随后被肝脏、肾脏快速清除，这使得临床应用时需反复给药，才能达到治疗效果。

miRNA表达的病毒载体包括慢病毒、腺病毒和腺相关病毒，也是一类重要的传递载体。这些装载miRNA基因表达盒子的病毒载体一旦转染宿主细胞，能长期地、持续稳定地高表达miRNA。但是使用病毒载体最大的问题是安全问题。病毒DNA整合入宿主基因组，导致病毒基因随机插入，可能使正常基因发生紊乱，激活有害基因，尤其是癌症基因，导致癌变或插入性基因突变。另外，利用病毒载体传递，很难实现精确靶向某些组织或细胞，容易出现非特异性不良反应。同时，腺病毒和腺相关病毒载体的转染也容易激活宿主的免疫反应。

3.2　miRNA调节药物的特异性和失靶作用　失靶作用的首次提出是在2003年，是指干扰性RNA作用于预期干扰的目标靶分子之外的其他细胞分子而产生的基因干扰行为 [21]。失靶作用的发生机制是miRNA 5′端的种子区域（核苷酸位置2–7或2–8）的反义链与其靶mRNA的3′非翻译区序列的完全匹配，种子区域的互补也是miRNA能作用于多个靶点的本质原因 [22]。多靶点的意义在于，miRNAs可同时靶向导致某一疾病的多个靶基因或一个基因家族的多个成员，类似设计如人工多靶点miRNA（SMART）。然而，多靶点也可能导致广泛性失靶，带来非预期的不良反应。研究发现，miR-208a调节横纹肌细胞肌球蛋白开关的同时，也能调节全身能量代谢和高脂饮食引起的肥胖 [23]。MiR-9、miR-15a、miR-27等9个miRNAs，既参与调节肥胖和糖尿病患者的葡萄糖和脂肪代谢，也参与癌症细胞的增殖、迁移和耐药 [24]。MiR-29模拟物是一种有潜力的抗癌药物，能靶向多个癌症相关的信号通路，但过表达miR-29将导致自身免疫疾病和骨髓过度增殖 [25-26]。静脉输注胆固醇结合的miR-10b阻断剂，能成功抑制小鼠乳房肿瘤的转移，但同时也改变了肝、脾的尺寸和血浆蛋白成分 [27]。

3.3　miRNA介导的药物或化合物的毒性　有关miRNA介导的毒性的报道中，最突出的一个研究是细胞短发夹RNAs （shRNAs）过饱和地结合sh/miRNA通路中的RNA转运蛋白Exportin-5，竞争性抑制内源性miRNA的加工合成，从而导致小鼠的肝毒性，加大小鼠死亡率 [28]。Let-7c是调节细胞生长的重要miRNA，研究表明过氧化物酶体增殖物激活受体α（PPARα）激动剂通过抑制let-7c可导致肝细胞增殖 [29]。药物或化合物等外源性物质的解毒主要靠肝脏中的代谢酶，例如细胞色素P450s（CYPs）。研究表明，miRNAs可在转录后水平调节CYPs表达，miR-27b、miR-126、miR-378和miR-125b分别在转录后水平抑制CYP1B1与CYP3A4、CYP2A3、CYP2E1和CYP24A1的表达。CYPs表达在转录水平上的调节受控于核受体，而孕烷X受体、维生素D受体（VDR）、人核因子4a（HNF4α）和人芳香烃受体核转运蛋白的表达也分别受miR-148a、miR-125b与miR-27b（VDR）、miR-24与miR-34a （HNF4α）和miR-24的调控 [30]。特异性miRNAs低调CYPs代谢酶的表达后，将导致机体对药物或外来化合物的代谢能力减弱，使化合物在体内蓄积导致毒性。

3.4　miRNA治疗药物的剂量考虑　有研究表明，气管内给予大剂量合成的CpG寡脱氧核苷酸将导致急性肺损伤，并激活全身免疫反应 [31]；不同剂量的miR-24阻断剂选择性沉默不同组织细胞中的miR-24 [32]。但目前大部分有关miRNA的动物实验中，为了得到所期望的阳性结果，一味地加大剂量，且仅验证目标组织器官所期望的生物效应，而其他组织器官以及目标组织器官的其他效应不予观察，这种剂量数据显然不切实际，临床应用时需重新设计。对于基于miRNA的治疗药物，存在饱和药物浓度的问题，即体内达到该药物浓度时，有限的靶mRNA被全部促进或抑制，超过这个浓度，药效不会增加，而不良反应反而加大。为了减小失靶和不良反应，可通过量-效关系实验确定药物的最低有效剂量。另外，通过制剂的修饰和改进，也可以降低有效剂量。研究表明给予LNA修饰的miR-122的寡核苷酸抑制剂只需1～25 mg/kg，便能起到相当于给予胆固醇修饰的miR-122抑制剂120～240 mg/kg对醛缩酶A的上调作用 [33]。

4　展望

尽管miRNA在临床病理、诊断和治疗方面的应用还处于起步阶段，miRNA治疗离安全有效地临床应用还有很大距离，但越来越多miRNA干预的成功应用已经在基础研究中被证实，有的已尝试进行药物的临床试验。迄今为止，研究最成熟的miRNA制剂是LAN修饰的miR-122拮抗剂靶向治疗丙型肝炎(HCV)，其机制是抑制HCV病毒RNA的复制。Ⅱ期临床试验结果显示，LAN修饰的miR-122拮抗剂治疗HCV具有良好的应用前景。快速发展的miRNA治疗将为人类疾病的基因治疗提供新的机遇，miRNA作为一类颇具潜力的药物作用新靶点，将更广泛地应用于人类疾病治疗领域。