基于显微—DNA条形码—产地分析联用的巴西柑橘属植物药FARINHA DE LARANJA (枳壳)基原鉴定研究

臧艺玫 顾选 余春霞 王娟 韩丽 吴浩忠 肖瑶 赵百孝 刘春生 马条华

·巴西草药研究专题·

基于显微—DNA条形码—产地分析联用的巴西柑橘属植物药FARINHA DE LARANJA (枳壳)基原鉴定研究

臧艺玫 顾选 余春霞 王娟 韩丽 吴浩忠 肖瑶 赵百孝 刘春生 马条华

目的 利用显微-DNA条形码-产地分析联用的方法对巴西柑橘属植物药FARINHA DE LARANJA粉末进行基原鉴定研究。方法 应用显微鉴定的方法对药材粉末的基原进行初步判定;再提取样品DNA,扩增ITS序列,利用NCBI数据库中的BLAST功能分析相似度,对样品品种进行DNA条形码鉴定;最后结合产地信息对数据库中的序列进行筛选。结果 显微-DNA条形码-产地综合分析结果表明,该样品为芸香科柑橘属Citrus L.植物酸橙Citrus aurantium的干燥未成熟果实粉末。结论 巴西植物药FARINHADE LARANJA的鉴定可为扩大枳实、枳壳等中药材的药用资源提供依据。

柑橘属; 药材粉末; 基原鉴定; DNA条形码

植物药基原鉴定的基本方法包括植物文献学研究、产地调研、标本采集和实验室植物分类鉴定等[1],但对于粉末类药材,由于其植物形态特征大部分已被破坏,以上方法均难以实行。笔者在巴西市场收集药材样本时发现,一种名为FARINHA DE LARANJA的粉末类药材来源无法确定,因此有必要对该药材进行基原鉴定。

由于不同科、属植物的显微结构具有不同特征,故可利用显微鉴别的方法初步对药材粉末进行鉴定[2];DNA条形码技术具有准确、快速、能鉴别无背景信息物种的优点[3-5],可对属内植物进行较为准确的鉴定;最后结合该属植物在产地的分布状况,可完成药材粉末的基原鉴定。本文拟采用显微-DNA条形码-产地分析联用的方法对FARINHA DE LARANJA粉末进行基原鉴定,以期为扩大柑橘属药用资源提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

FARINHA DE LARANJA样品10份,每份200 g, 2012年4月购买于巴西隆城市场药材集散地,样品的凭证标本保存于北京中医药大学标本室。

1.2 试剂

广谱植物基因组 DNA快速提取试剂盒(北京博迈德生物有限公司,批号:69632855)、rTaq酶(上海生工生物工程有限公司,批号:695673BE)、乙醇(北京化工厂,批号:1124120381060079)、琼脂糖(BIOWEST,批号:142045)、ddH2O等。

1.3 仪器

显微镜(OLYMPUSCX-21,中国),SY-601超级恒温水浴(天津欧诺仪器仪表有限公司),L-901涡旋振荡仪(海门市其林贝尔仪器制造有限公司), JA1103N千分之一精密电子天平,SIGMA3K-15低温高速离心机(SIGMA公司),TECHNE TC-3000PCR扩增仪,Bio-Rad电泳仪,水平电泳槽(北京六一仪器厂),JS-680B全自动凝胶成像分析仪(上海培清科技有限公司),GRANT制冰机,超纯水制备系统,KQ5200E型超声波清洗器,SANYO-80℃超低温冰箱(SANYO公司),DHG-9145A型电热恒温鼓风干燥箱(上海一恒科学仪器有限公司)。

1.4 基于显微的鉴定方法

按照《中华人民共和国药典》(一部)[6]中显微鉴定的方法,比较样品与中药材枳实显微特征的异同。

1.5 DNA条形码鉴定方法

取10份样品,观察形态,形态结果一致。每份样品取40 mg进行DNA提取。各份样本分别用液氮冷冻后研磨成细粉,按照广谱植物基因组DNA快速提取试剂盒操作步骤提取样品DNA,1%琼脂糖凝胶电泳检查DNA纯度及完整性。采用ITS (internal transcribed spacer)序列通用引物对样品进行PCR扩增,ITS-R:5＇-CGTAACAAGGTTTCCGTAGGTGAA-3＇,ITS-F:5＇-TTATTGATATGCTTAAACTCAGCGGG-3＇。PCR扩增条件:50μL体系含2×Taq PCR MasterMix 25μL,ITS-R(5μmol/L) 2.5μL,ITS-F(5μmol/L)2.5μL,DNA模板4μL,ddH2O 16μL。PCR扩增程序:94℃预变性5分钟,94℃变性1分钟,55℃退火1分钟,72℃延伸1分钟,35个循环;72℃再延伸10分钟。PCR产物经1%的琼脂糖凝胶电泳检测,条带单一明亮者即扩增成功。PCR扩增产物经纯化后,送上海生工生物工程有限公司测序部测序。各样品均采用正向和反向测序,以保证测序的准确性。

利用ContigExpress软件对测序获得的正、反向序列进行拼接,以TCGA/T和GACCC/TC作为ITS序列边界截取ITS序列,然后利用相似度法分析序列。

根据 NCBI中相似度搜索法(basic local alignment search tool,BLAST)功能,检索样品的ITS序列,本文以相似度90%以上为属的鉴定依据,以相似度97%以上的最高相似度物种为物种鉴定依据,获得鉴定结果。若BLAST比对后得到的序列相似度均在97%以下,则认为数据库中可能未注册该序列,此时,根据“DNA条形码鉴定方法”仅能鉴定到属水平;该属中未注册序列的物种可能为鉴定结果。

1.6 基于产地分析的鉴定方法

根据“基于DNA条形码鉴定方法”项下获得的科、属和种的鉴定结果,依据《巴西植物志》记载的巴西分布的该属植物物种信息,依次分析最高相似度物种的产地是否相符合,如果符合,则为产地鉴定结果,继续进行下一项分析;如果不符合,则分析第二最高相似度物种,以此类推,分析直至相似度97%的物种。若相似度在97%以上的物种产地均与样品产地不相符合,则认为数据库未注册该样品序列,无法根据“基于产地分析的鉴定方法”准确鉴定到种水平。

2 结果

2.1 FARINHADE LARANJA粉末的显微鉴定结果

FARINHADE LARANJA粉末的显微特征如下:粉末黄白色或浅黄色;中果皮细胞较多,类圆形或形状不规则,壁大多呈不规则增厚;草酸钙方晶存在于果皮和汁囊细胞中,呈斜方形、多面体形或双锥形,直径3～30μm;汁囊组织淡黄色或无色,细胞多皱缩,并与下层细胞交错排列;螺纹导管、网纹导管及管胞细小;果皮表皮细胞表面观多角形、类方形或长方形,见图1、图2。显微特征分析表明,本品粉末的显微特征与中药材枳壳基本相同[7],而无枳实的“橙皮苷结晶、油室碎片”等显微特征,故初步判定该粉末的来源为柑橘属 Citrus L.植物酸橙Citrus aurantium的干燥未成熟果实。

2.2 DNA条形码鉴定结果

2.2.1 科属的鉴定 10份样品的测序峰图良好,测序结果一致,选择一条序列用于后续分析。截取ITS片段后,经BLAST检索,样品与芸香科柑橘属Citrus L.植物相似度最高,相似度范围为90% ～100%,与其他属相似度均低于97%。因此,该样品来自芸香科柑橘属Citrus L.植物。

2.2.2 种的鉴定 根据分子鉴定指标(相同物种相 似 度 达 到 97% 以 上),Citrus clementina (XM006423861. 1, 100%)、 Citrus reticulata (FJ641932.1,100%)、Citrus sinensis(JN681150.1, 100%)及Citrus aurantium(AB456074.1,98%)等植物可能为FARINHA DE LARANJA的基原,其中,最佳鉴定结果为Citrus clementina。

2.3 基于产地分析的鉴定结果

《巴西植物志》记载柑橘属7种植物 C. aurantium、C.decumana、C.limetta、C.limonum、C. medica、C.spinosissima(未注册)、Citrus vulgaris,根据DNA条形码鉴定结果,最佳鉴定结果不在巴西分布,在相似度97%以上的可能基原中,只有Citrus aurantium在巴西生长,且在巴西以果实入药,因此,根据产地分析,FARINHA DE LARANJA的基原为芸香科柑橘属酸橙Citrus aurantium。

3 讨论

粉末类的药材易于取用且冲泡便捷,但由于性状特征不明显,其真伪鉴别一直是植物药鉴定中的难点。显微鉴定是传统鉴定中的常用方法之一,它能够对药用部位进行较为准确的判断,但由于属内植物可能存在组织特征的相似性,部分近缘种药材较难利用显微鉴别区分[8]。DNA条形码技术准确度更高,且不依赖于药材形态及鉴定人员经验[9],更适用于粉末类药材的鉴定。DNA条形码的序列分析主要依靠NCBI数据库中注册的序列,还需根据本批药材的已知产地来源对数据库中的序列依次进行筛选,最终结合入药部位确定最佳鉴定结果。

本文研究表明,本次收集的 FARINHA DE LARANJA药材的基原植物为芸香科酸橙 Citrus aurantium的干燥未成熟果实,与2010版《中华人民共和国药典》(一部)中记载的枳壳基原植物相同。但其是否可被当做枳壳使用,尚需对其主要化学成分进行含量测定及分析研究。

巴西是全世界柑橘属Citrus L.产品产量最大的国家,酸橙作为柑橘属的一种,产量也高于其他产地[10-11]。因此,中国可在巴西建立酸橙栽培基地,适当的进口巴西酸橙幼果和未成熟果实,进而扩大中药材枳实和枳壳的药用资源。

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The variety identification of FARINHA DE LARANJA powder in Brazil based on a combined analysis ofm icroscopic-DNA barcoding-origin

ZANG Yi-mei,GU xuan,YU Chun-xia,et al. SchoolofChinese Materia Medica,Beijing University ofChinese Medicine,Beijing 100102,China Corresponding author:LIU Chun-sheng,E-mail:max_liucs@263.net

Objective o study the variety identification of a kind of herbal powder of FARINHA DE LARANJA of Citrus L.in Brazil with a combaned analysis ofmicroscope-DNA barcoding-origin. M ethods Microscopic identification was used to identify the variety of samples preliminarily;then ITSsequences were amplified by PCR and sequenced,and BLAST in NCBI database was used to calculate the similarity of sequences to identify variety of samples.,Finally,the DNA barcoding identification results were screened and analyzed according to its geographical origin information.Results The combined analysis of microscopic-DNA barcoding-origin indicated that FARINHA DE LARANJA collected from market in Brazilwas the dried fruit powder of Citrus aurantium.Conclusion The identification of Brazil FARINHADE LARANJA could enrich the alternative resources of Zhiqiao and Zhishi.

Citrus L.; Powder; Varieties identification; DNA barcoding

R284

A

10.3969/j.issn.1674-1749.2015.11.008

2015-08-22)

(本文编辑:董历华)

国家国际科技合作专项(2011DFA31370)

100102 北京中医药大学中药学院[臧艺玫(硕士研究生)、顾选、王娟、肖瑶、吴浩忠、刘春生、马长华],针灸推拿学院(赵百孝);北京华邈中药工程技术开发中心(顾选);河南省药品审评认证中心(余春霞);中医养生学研究所[韩丽(硕士研究生)]

臧艺玫(1990-),女,2013级在读硕士研究生。研究方向:药用植物与分子生药学。E-mail:meiyee0810@sina.com

刘春生(1964-),博士,教授,博士生导师。研究方向:药用植物与分子生药学。E-mail:max_liucs@263.net