猪细小病毒SYBR Green I荧光定量PCR诊断试剂盒的研制

余波+周思旋+谭诗文+徐景峨+史开志+杨莉

摘要：根据GenBank中猪细小病毒VP2基因序列设计特异性的引物，PCR扩增获得猪细小病毒VP2基因片段，并克隆到pMD-18T载体上作为阳性标准品。通过对SYBR Green I荧光定量PCR反应条件的优化，建立了猪细小病毒的SYBR Green I荧光定量PCR诊断方法，以此为基础研制出试剂盒。试剂盒扩增产物的熔解曲线分析只出现1个单特异峰，无引物二聚体，对PRV、PCV-2、E.coli、CSFV、PRRSV均无阳性信号扩增，可重复性好，测灵敏度可达1.0×101拷贝/μL。结果表明，研制的猪细小病毒SYBR Green I 实时荧光定量PCR试剂盒具有特异、灵敏、快速、重复性好等优点，适合于猪细小病毒临床样品的检测。

关键词：猪细小病毒；VP2基因；SYBR Green I荧光定量

中图分类号：S852.65+9.1 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2015）01-0126-04

猪细小病毒（Poreine parvovirus，PPV）是引起母猪繁殖障碍性疾病的主要病原体之一，可导致母猪流产、死胎，给养猪业造成了巨大的经济损失[1-3]。目前，对该病的诊断方法包括传统的病毒分离鉴定，以及血清学诊断方法，如ELISA、胶体金等。常规的PCR主要用于病死猪组织样本的检测，然而PPV常呈长期低剂量隐性感染，常规的PCR不仅无法对血清样本中的病毒进行定量检测，而且扩增反应后需要电泳检测，操作繁琐。荧光定量PCR是与常规PCR比较，具有重复性好、灵敏度高、能够定量等优点，已经被广泛应用于多种疾病病原的检测[4，5]。本研究根据GenBank中猪细小病毒VP2基因序列设计特异性的引物，利用PCR技术扩增获得猪细小病毒VP2基因片段，并克隆到pMD-18T载体上作为阳性标准品。通过对SYBR Green I荧光定量PCR反应条件的优化，研制出猪细小病毒的SYBR Green I荧光定量PCR诊断试剂盒，为猪细小病毒临床样品的检测提供科学的诊断方法。

1 材料与方法

1.1 试验材料

菌株：PPV强毒株7909、PRV闽-1株、PCV-2、CSFV、PRRSV、猪源大肠杆菌由贵州省畜禽疫病研究实验室保存。

主要试剂及仪器：Goldview、Tris、EDTA、DL2000、Taq DNA Polymerase（5U/μL）及相应10×Taq Buffer、dNTP、DH5α，pMD-18T、SYBR Green I荧光定量PCR酶等购自宝生物（大连）工程有限公司；TIANamp病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒购自天根生化科技有限公司。荧光定量PCR仪为Eppendorf Mastercycler ep realplex 4 实时荧光定量PCR仪。

1.2 试验方法

1.2.1 引物设计

根据GenBank中猪细小病毒VP2基因序列设计1对特异性引物，上游引物：5′-GGGAGGGCTTGG

TTAGAATC-3′，下游引物：5′-TTGTTTGCCATGAGTGAGTT-3′，引物由宝生物（大连）工程有限公司合成。

1.2.2 病毒核酸的提取

1）组织样品：取待检样品淋巴结组织样品共约0.5 g，加入500 μL PBS缓冲液，待检样品研磨后 -70 ℃反复冻融3次，12 000 r/min离心取上清液用于核酸的提取。病毒DNA/RNA的提取参照TIANamp病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒说明书进行，将提取的DNA/RNA于-70 ℃保存。猪大肠杆菌参照细菌基因组DNA提取试剂盒说明书进行，将提取的DNA-20 ℃保存。

2）血清样品：取50 μL血清加入等体积的血清裂解缓冲液[50 μmol/L Tris-HCl（pH 8.0），150 μmol/L NaCl，2 μmol/L EDTA，1%Triton×100，5% SDS]，混匀后煮沸5 min，12 000 r/min离心取上清液2 μL用于荧光定量PCR和普通PCR。

1.2.3 pMD-18T-PPV-VP2阳性标准品的制备 用“1.2.1”中的引物，对PPV DNA进行PCR扩增，反应条件为：94 ℃ 5 min；94 ℃ 1 min，退火温度55 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，30个循环；最后72 ℃延伸10 min。将扩增的108 bp PCR产物用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收DNA片段，与pMD-18T-克隆载体连接，转化感受态细胞DH5α，重组体命名为pMD-18T-PPV-VP2，同时送宝生物工程（大连）有限公司测序。用紫外分光光度计测定测序正确的重组质粒pMD-18T-PPV-VP2在D260 nm/D280 nm处的吸光度，得到重组质粒的浓度和纯度，进行10倍梯度倍比稀释，作为阳性标准品。

1.2.4 荧光定量PCR反应条件的优化 荧光定量PCR反应在25 μL反应体系中进行，对荧光定量PCR反应条件，包括退火温度（50、55、60 ℃），引物浓度（5、10、20 μmol/L），进行优化以确定最佳反应条件。上下游引物（5、10、20 μmol/L）各1 μL，Premix Ex-Taq 12.5 μL，ROX Reference Dye 0.5 μL，模板1 μL，用超纯水补足至25 μL，同时以超纯水作为空白对照。反应条件为：94 ℃ 10 s；94 ℃ 5 s，退火温度（50 ℃、55 ℃、60 ℃）10 s，72 ℃ 10 s，40个循环。

1.2.5 荧光定量PCR反应标准曲线的建立 用紫外分光光度计测定测序正确的重组质粒pMD-18T-PPV-VP2，计算出重组质粒的浓度和纯度，计算DNA拷贝数，随后将标准阳性样本进行连续10倍系列稀释，以“1.2.4”的条件进行扩增，每个稀释倍数3个重复，以拷贝数为横坐标，以Ct值为纵坐标建立标准曲线。endprint

1.2.6 敏感性试验 将重组质粒pMD-18T-PPV-VP2计算DNA拷贝数后，进行10倍比稀释后分别进行荧光定量PCR反应，每个稀释倍数3个重复，以确定建立的荧光定量PCR诊断的敏感性。

1.2.7 特异性试验 以PPV、PCV-2、PRV、E.coli DNA、CSFV、PRRSV cDNA进行荧光定量PCR反应，每个样品3个重复，以确定建立的荧光定量PCR诊断方法的特异性。

1.2.8 重复性试验 应用建立的荧光定量PCR方法重复检测PPV DNA样品3次，以检验结果的可靠性。

1.2.9 试剂盒的组装与保存期检测 应用建立的荧光定量PCR组装成试剂盒。试剂盒组成：①荧光定量PCR反应混合液；②ROX Reference Dye；③引物；④阴性对照；⑤阳性对照；⑥去离子水；⑦裂解液。将试剂盒各组份分别保存于室温、4 ℃和-20 ℃，设置1周、6个月、1年3个时间梯度，对阳性菌株进行检测。

1.2.10 荧光定量PCR试剂盒对临床样品的检测 对2012～2013年贵州省贵阳市、黔西南、遵义、黔南州、铜仁地区几个生猪养殖场和养殖专业户采集的69份疑似病料，181头份发病猪场未发病猪血清，应用研制的试剂盒进行检测，同时应用文献[6]中的方法进行普通PCR。

2 结果与分析

2.1 pMD-18T-PPV-VP2阳性标准品的制备

用“1.2.1”中的引物，对PPV DNA进行PCR扩增，能有效扩增出了目的片段，片段大小为108 bp，无非特异性片段产生（图1）。将宝生物（大连）工程有限公司测序结果与GenBank中的PPV-VP2基因序列比对，核苷酸相似度为98.9%～100%。

2.2 荧光定量PCR反应条件的优化

荧光定量PCR反应在25 μL反应体系中最佳反应条件为：退火温度55 ℃，引物浓度10 μmol/L，能出现最高的荧光值、最小的Ct值，且在熔解曲线分析中不出现非特异性峰。

2.3 荧光定量PCR反应标准曲线的建立

将标准样品10倍倍比稀释，取1.0×106、1.0×105、1.0×104、1.0×103、1.0×102、1.0×101拷贝/μL 6种不同浓度重组质粒作为模板进行荧光定量PCR扩增反应，得到扩增反应的标准曲线（图2），线性回归方程为Ct=-3.141×lg拷贝数+26.7（R2=0.996）。

2.4 熔解曲线分析

在SYBR Green I荧光定量PCR结束后对扩增反应进行熔解曲线分析，结果见图3。扩增产物的溶解温度Tm为78.6～79.0 ℃，没有引物二聚体和非特异性产物等其他峰值出现。

2.5 敏感性试验

将标准样品10倍倍比稀释，取1.0×106、1.0×105、1.0×104、1.0×103、1.0×102、1.0×101、1.0×100 拷贝/μL 7种不同浓度重组质粒作为模板进行荧光定量PCR扩增。由图4可知，结果显示其灵敏度为1.0×101拷贝/μL。

2.6 特异性试验

由图5可知，以PPV、PCV-2、PRV、E.coli DNA、CSFV、PRRSV cDNA进行荧光定量PCR反应，以确定建立的荧光定量PCR诊断方法的特异性，结果PPV为阳性，而PCV-2、PRV、E.coli DNA、CSFV、PRRSV cDNA为阴性。

2.7 重复性试验

应用建立的荧光定量PCR方法重复检测PPV DNA样品3次，以检验结果的可靠性，结果均一致。

2.8 试剂盒的组装与保存期检测

应用建立的荧光定量PCR组装成试剂盒。试剂盒组成：①荧光定量PCR反应混合液（Premix Ex Taq）250 μL；② ROX Reference Dye 20 μL；③引物 40 μL；④阴性对照 20 μL；⑤阳性对照 20 μL，⑥去离子水500 μL；⑦裂解液 800 μL。将试剂盒保存在4 ℃、-20 ℃分别于1个月、3个月、6个月、1年对阳性样品进行检测，4 ℃保存1年阳性拷贝数降低99%，-20 ℃保存1个月、3个月、6个月、1年对阳性拷贝数无影响。

2.9 试剂盒对临床样品的检测

对2012～2013年贵州省贵阳市、黔西南、遵义、黔南州、铜仁地区几个生猪养殖场和养殖专业户69份疑似病料（组织）的荧光定量PCR阳性率为36.2%（25/69），普通PCR阳性率为33.3%（23/69）。181头份发病猪场未发病猪血清荧光定量PCR阳性率为10.0%（18/181），普通PCR阳性率为0%（0/181）。

3 小结与讨论

猪细小病毒VP2基因是其主要免疫原性蛋白，在决定毒株的组织嗜性和致病性上起重要作用[7-9]。王金良等[10]应用猪细小病毒VP2全基因进行原核表达建立了间接ELISA检测方法。赵俊龙等[11]根据猪细小病毒VP2基因，建立的猪细小病毒PCR方法能检测出10-4×TCID50的病毒含量。但普通PCR检测的灵敏度相对较低，主要用于组织病料的检测，不能有效检出猪群血清中PPV的隐形感染。李小康等[12]建立基于TaqMan探针的猪细小病毒荧光定量PCR检测方法，该方法的敏感性为100拷贝/μL，可有效检测出淋巴结、肺脏等组织中的PPV，但其未对感染猪场未发病猪血清进行检测。

基于SYBR GreenⅠ的实时荧光定量PCR技术则无需探针，且价格较TaqMan探针低廉，但荧光染料能和任何双链DNA结合。因此，它也能与非特异的双链DNA（如引物二聚体）结合，容易产生假阳性信号，但可以通过融解曲线分析克服这一缺陷[13]。本研究根据猪细小病毒VP2基因序列设计特异性的引物，利用PCR技术扩增获得猪细小病毒VP2基因片段，并克隆到pMD-18T载体上作为阳性标准品。通过对SYBR Green I荧光定量PCR反应条件的优化，建立了猪细小病毒的SYBR Green I荧光定量PCR诊断方法，灵敏度可达1.0×101拷贝/μL，扩增产物的溶解温度Tm为78.6～79.0 ℃，没有引物二聚体和非特异性产物等其他峰值出现，适合于临床样品的检测。endprint

本研究中69份疑似病死猪病料（组织）中病毒含量量较高，因此荧光定量PCR和普通PCR符合率为92.0%，而发病猪场未发病猪血清PPV病毒含量较低，普通PCR未检测到血清中的病毒，而研制的试剂盒能检测到隐性感染的PPV。因此，本试剂盒可应用于PPV早期感染和隐性感染检测，有利于猪场PPV的净化。

参考文献：

[1] 殷 震，刘景华.动物病毒学[M].第二版.北京：科学出版社，1997.

[2] 李刚明，姜天童，方雨玲，等.猪细小病毒的分离与鉴定[J].中国兽医科技，1994，24（10）：19-20.

[3] 戎 伟，杨润德.聚合酶链式反应检测猪细小病毒方法的研究[J].中国预防兽医学报，2004，26（6）：465-467.

[4] 袁亚男，刘文忠.实时荧光定量PCR技术的类型、特点与应用[J].中国畜牧兽医，2008，35（3）：27-30.

[5] 李 安，谢金文，魏加贵，等.荧光定量PCR技术在分子检测上的研究进展[J].中国畜牧兽医2009，36（4）：73-77.

[6] 余 波，谭诗文，冉懋韬，等.检测PRV野毒株、PCV-2及PPV多重PCR方法的建立及初步应用[J].畜牧与兽医，2010，42（5）：15-18.

[7] MOLITOR T H， JOO H S， COLLETT M S.Porcine parvovirus： virus purification and structural and antigenic properties of virion polypeptides[J]. J Viml，1983，45：842-854.

[8] 刘艳华，范伟兴，隋兆峰，等.猪细小病毒SD-68株VP2基因的克隆及序列分析[J].中国病毒学，2004，19（6）：568-571.

[9] 赵俊龙，陈焕春，吕建强，等.猪细小病毒VP2基因的克隆、测序与原核表达[J].畜牧兽医学报，2003，34（2）：195-198.

[10] 王金良，沈志强，唐 娜，等.猪细小病毒PPV-SD1及间接ELISA株VP2全基因原核表达检测方法的建立[J].中国兽医杂志，2008，44（7）：22-24.

[11] 赵俊龙，陈焕春，吕建强，等.猪细小病毒PCR检测方法的建立与应用[J].中国兽医学报，2003，23（2）：142-144.

[12] 李小康，崔保安，陈红英，等.实时荧光定量PCR检测猪细小病毒[J].中国兽医学报，2008，28（10）：1118-1121.

[13] 沈志强，王金良，郭显坡，等.SYBR Green I实时荧光定量PCR检测猪细小病毒方法的建立及初步应用[J].中国兽医学报，2011，31（1）：11-15.endprint