H2O2对牡丹愈伤组织分化及抗氧化酶活性的影响

贺丹　毛仓仓　陈颖　王政　何松林

摘要：以凤丹白牡丹（Paeonia suffruticosa Andr.）继代愈伤组织为材料，研究不同外源H2O2浓度下牡丹愈伤组织生长过程中过氧化物酶（POD）、过氧化氢酶（CAT）和超氧化物歧化酶（SOD）活性的变化，探究酶活性变化与牡丹愈伤组织生长、分化的关系。结果表明，在愈伤组织生长过程中，当H2O2浓度达到50 μmol/L以上时，愈伤组织形态均出现了不同程度的变化；100 μmol/L H2O2处理的SOD活性在第5天达到峰值，与其他处理呈显著差异，之后逐渐下降；POD和CAT活性变化基本一致，在第5天出现明显上升，之后下降，然后趋于平稳。从形态观察和3种抗氧化酶活性结果来看，100 μmol/L H2O2对牡丹胚性愈伤组织的形成和体细胞胚的诱导有促进作用。

关键词：外源H2O2；牡丹（Paeonia suffruticosa Andr.）；愈伤组织分化；抗氧化酶活性

中图分类号：S685.11 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2015）01-0122-04

牡丹（Paeonia suffruticosa Andr.）别名木芍药、富贵花，为芍药科芍药属宿根木本花卉[1]。目前，生产上仍以播种、分株、嫁接等传统方法进行繁殖，其结实率低，无性繁殖速度慢等问题限制了品种选育工作的开展。组织培养技术为缩短牡丹的繁育周期提供了可能，但还没有形成较完善的技术体系[2]。牡丹愈伤组织分化困难一直是制约再生体系建立的瓶颈[3]，通过直接途径获得了少量的牡丹体细胞胚[4，5]。通过间接途径即体细胞诱导成胚性愈伤组织，胚性愈伤组织再发育成体胚，诱导产生牡丹体胚尚未见报道。

过氧化氢（H2O2）是活性氧的重要代表之一，激素等信号以及生物、非生物胁迫刺激均可诱导植物细胞内H2O2的产生和积累。近年来，有学者认为H2O2可能是一种细胞信号传导物质，有可能通过细胞的信号传递系统影响基因的调控表达，从而诱导胚性细胞的形成[6，7]。从本质上讲，胚性愈伤组织的形成过程也就是愈伤组织的分化过程，这一过程的核心是基因的差别表达。有研究表明，在枸杞体细胞胚发生过程中，一定浓度的外源H2O2可提高愈伤组织中体细胞胚的发生频率，对细胞分化及体细胞胚发生有促进作用[7]。过氧化物酶（POD）、过氧化氢酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）等酶活性的变化与愈伤组织的生长及分化过程密切相关。有研究表明，在枸杞的体细胞胚发生过程中，3种酶相互配合来调节胚性细胞的分化与发育，且在胚胎发生与发育过程中具有特异性变化[7]；在大蒜体细胞胚胎发生过程中，这3种酶活性的变化与胚性愈伤组织的诱导及体胚的发育密切相关[8]；POD在石刁柏和小麦的体细胞胚胎发生、发育的各个时期，其活性均高于对照[9，10]。本研究以凤丹白牡丹的继代愈伤组织为材料，尝试利用外源H2O2诱导牡丹胚性愈伤组织，研究诱导过程中POD、CAT和SOD活性的变化，探究酶活性变化与愈伤组织生长、分化的关系，旨在为牡丹体细胞胚的发生提供研究基础。

1 材料与方法

1.1 供试材料

2012年2月采集凤丹白牡丹鳞芽，采集地点为洛阳市土桥花木种苗有限公司牡丹苗木基地。将鳞芽灭菌后接种到MS+0.5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA+7 g/L琼脂+30 g/L蔗糖（pH 5.8）的固体培养基上，培养30 d后获得牡丹试管苗。然后将试管苗的叶柄在无菌条件下转入MS+ 1.0 mg/L 6-BA+ 1.0 mg/L 2，4-D +7 g/L琼脂+30 g/L蔗糖（pH 5.8）的固体培养基上，培养40 d后获得愈伤组织。愈伤组织在无菌条件下再转入MS+1.0 mg/L 6-BA+ 1.0 mg/L NAA+7 g/L琼脂+30 g/L蔗糖（pH 5.8）的固体培养基上，进行增殖培养，获得继代愈伤组织。以上培养条件均为温度（24±1） ℃，光照度40 μmol/（m2·s），光照时间12 h/d。

1.2 试验方法

将获得的凤丹白继代愈伤组织转入添加有4种不同浓度H2O2（处理Ⅰ 50 μmol/L、处理Ⅱ 100 μmol/L、处理Ⅲ 200 μmol/L、处理Ⅳ 300 μmol/L）的MS+1.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L NAA+7 g/L琼脂+30 g/L蔗糖（pH 5.8）的固体培养基上进行培养，每处理接种20瓶。

1.3 测定方法

供试材料转入含有不同浓度H2O2的培养基后，分别于0、5、10、15、20、25 d进行随机取样。准确称取材料0.2 g，加2 mL磷酸缓冲液（50 mmo1/L，含1%PVP及0.2 mmo1/L EDTA，pH 7.8）及少量石英砂，于冰浴中研磨，匀浆液于4 ℃，12 000 r/min离心15 min，上清液用于酶活性的测定，3次重复。

POD、CAT活性测定参照李合生[11]的方法，略加改动。SOD活性测定参照赵世杰[12]的方法。

1.4 数据统计与分析

试验数据采用邓肯氏新复极差法（SSR法）检测其差异显著性，采用Excel软件和DPS软件3.01版对数据进行统计处理。

2 结果与分析

2.1 H2O2对牡丹愈伤组织生长分化的影响

供试材料转入含有不同浓度H2O2的培养基后，经过25 d的培养后，观察牡丹愈伤组织的生长变化，结果如图1所示。从图1中可以看出，在不同浓度H2O2处理条件下，牡丹愈伤组织的生长呈不同的变化。处理Ⅰ的愈伤组织呈绿色至黄绿色，形态较致密；处理Ⅱ出现了一定程度的褐化，愈伤组织表面及边缘出现较多类似球形胚的凸起，与周围愈伤组织易于剥离；处理Ⅲ与处理Ⅳ愈伤组织表面出现少量凸起，多呈黄绿色至白色，处理Ⅳ的褐化情况较严重，接种的20瓶中均有不同程度的污染。endprint

2.2 牡丹愈伤组织生长过程中POD活性的变化

如图2所示，牡丹愈伤组织转入含有不同浓度H2O2的培养基后，4个处理愈伤组织的POD活性整体呈上升-下降-平稳的趋势。其中0～5 d，除处理Ⅲ外，其他处理的POD活性均大幅上升；5～10 d，处理Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ的POD活性急速下降，处理Ⅲ愈伤组织的POD活性呈缓慢下降的趋势，并于第10天出现最低值132.75 U/（g·min）；10～15 d，处理Ⅰ愈伤组织的POD活性平缓下降，处理Ⅱ、Ⅳ愈伤组织的POD活性继续大幅下降，而处理Ⅲ的POD活性则缓慢上升；15～25 d，处理Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ愈伤组织的POD活性则保持缓慢上升的趋势，第25天分别达到279.94、309.38、308.06 U/（g·min）。从POD活性的整体变化来看，除处理Ⅲ外，其他处理在5 d前后出现了剧烈变化，15 d后变化趋于平缓。

2.3 牡丹愈伤组织生长过程中SOD活性的变化

如图3所示，将牡丹愈伤组织转入含有不同浓度H2O2的培养基后，4个处理的SOD活性整体变化趋势较为平缓。其中0～5 d，4个处理的SOD活性均有上升，处理Ⅱ的变化最大，达到了382.56 U/（g·min）；5～10 d，处理Ⅱ的SOD活性有小幅下降，并于第10天出现较低值317.69 U/（g·min），而处理Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ的SOD活性均呈上升趋势；10～15 d， 4个处理的SOD活性均缓慢上升，且于第15天分别达到342.58、340.71、348.21、347.44 U/（g·min）；之后，4个处理的SOD活性呈下降趋势，第25天分别降至219.72、177.33、201.61、291.62 U/（g·min）。从SOD的活性变化来看，处理Ⅱ的SOD活性在第5天达到了峰值，并与其他处理显著差异。

2.4 牡丹愈伤组织生长过程中CAT活性变化

如图4所示，将牡丹愈伤组织转入含有不同浓度H2O2的培养基后，0～5 d，4个处理的CAT活性均呈上升趋势；5～10 d时，又迅速下降；10～15 d，处理Ⅰ、Ⅱ的CAT活性持续下降，并于第15天降至最低值237.5、187.5 U/（g·min），而处理Ⅳ的CAT活性则又出现上升；15～20 d，处理Ⅲ的CAT活性继续下降并于第20天出现最低值187.5 U/（g·min）；20～25 d，处理Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的CAT活性保持快速上升趋势，处理Ⅳ的CAT活性则缓慢下降。

3 小结与讨论

本试验研究H2O2对牡丹体细胞胚诱导的作用，通过对愈伤组织生长形态的观察及抗氧化酶（POD、SOD、CAT）活性的测定，初步发现一定浓度的H2O2对诱导牡丹体细胞胚形成起促进作用。这3种酶与胚性愈伤组织的诱导有密切关系，它们相互配合调节胚性愈伤组织的生长与分化[8]。

崔凯荣等[7]、邢更妹等[13]认为当继代愈伤组织转入分化培养基后，SOD活性呈上升趋势，直到多细胞原胚期，SOD活性达到最高峰，表明SOD活性升高对胚性细胞的分化以及早期胚胎发育有促进作用。本试验中第5天，除处理Ⅱ的SOD活性达到峰值，之后下降，而其他处理的变化趋势较为平缓，因此在本试验中处理5 d可能是胚性细胞分化的时期。崔凯荣等[7]以枸杞为材料进行研究，结果表明转入分化培养基的继代愈伤组织只有在SOD活性升高时才会发生细胞分化，同时认为细胞的分化取决于SOD与H2O2的相互作用。另外，很多研究表明，胚性愈伤组织中SOD、POD、CAT的活性均较高[15]，说明胚性愈伤组织细胞的适应性、抗逆性强于非胚性愈伤组织，能够为胚性细胞分化、体胚的产生创造有利的条件[16，17]。POD与CAT是与清除H2O2相关的酶类[18]，本试验中当H2O2浓度为100 μmol/L时，两者的变化基本一致，这与枸杞[7]、木薯[19]的体胚发生过程中POD、CAT活性变化趋势相一致。而詹园凤等[8]在研究大蒜体细胞胚发生过程中发现，POD活性的变化趋势与SOD和CAT活性的变化趋势相反，这可能是不同作物体胚发生过程中抗氧化系统的协调方式不同所致。

在体细胞胚的诱导及发生时间方面，不同物种的差异不大。枸杞在由继代愈伤组织转入分化培养基后，经3 d培养即开始有胚性细胞形成，15 d左右时即形成大量球形胚[7]。樱桃番茄在转入分化培养基后，14 d球形胚开始形成，经历心形胚、鱼雷胚后35 d开始形成子叶胚[20]。石刁柏在培养1个月后，可以在培养物中挑选出愈伤组织、球形胚、梨形胚、成熟胚等[21]。本试验的形态观察和3种抗氧化酶活性的结果表明，100 μmol/L H2O2对牡丹胚性愈伤组织和体细胞胚的诱导有促进作用，后期应在培养方式、培养时间等方面进一步深入研究，以获得理想的结果。

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