烟草青枯菌拮抗放线菌和细菌的田间试验

陆铮铮　蒋选利

摘要：从健康烟草根围土壤中分离、筛选得到对烟草青枯病菌拮抗效果较好的放线菌和细菌。经鉴定两株拮抗放线菌均属链霉菌属（Streptomyces），分别是绿色类群橄榄绿链霉菌（S. olivaceoviridis）、粉红孢类群玫瑰暗黄链霉菌（S. roseofulvus）；拮抗细菌分别为蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）、球形赖氨酸芽孢杆菌（Lysinibacillus sphaericu）。在贵州省麻江县烟田进行田间试验，3次平均相对防效从大到小依次为粉红孢类群玫瑰暗黄链霉菌（63.65%）、球形赖氨酸芽孢杆菌（60.03%）、蜡样芽孢杆菌（43.85%）、绿色类群橄榄绿链霉菌（41.76%）、40%硫酸链霉素（17.11%）。

关键词：烟草青枯病；放线菌；细菌；田间试验

中图分类号：S435.72 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2015）01-0087-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.01.022

由青枯劳尔氏菌（Ralstonia solanacearum E.F.Smith）引起的烟草青枯病，又称烟瘟、“半边疯”，素有植物“癌症”之称[1]。该病菌可以侵染50多个科的200多种植物[2]，传播速度快，存活时间长[3]，造成的危害严重，给许多农作物带来了巨大的伤害。目前对烟草青枯病的防治尚未有理想的药剂，且抗病品种的应用也常受到自然条件的限制和抗性丧失等问题的困扰[4]。Cook等[5]和Chef[6]通过向土壤施加拮抗微生物来防治土传病害，并取得了一定的防治效果。研究者认为生物防治在未来农业生产中具有重要地位。

前期研究分离了烟草根围土壤中的微生物，通过平板对峙法筛选出了2株拮抗放线菌（平均抑菌圈直径分别为43.20 mm、54.66 mm）和2株拮抗细菌（平均抑菌圈直径分别为39.98 mm、48.88 mm）。2011年4月，选择在贵州麻江杏山镇麒麟村烟田中进行田间效果试验，通过采用浸根、灌根的处理方法和3次病害调查的平均结果对田间效果进行了评价。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1供试放线菌和细菌 选择抑制效果最好的2株放线菌，分别为绿色类群橄榄绿链霉菌（Streptomyces olivaceoviridis，编号为F4-3）、粉红孢类群玫瑰暗黄链霉菌（S. roseofulvus，编号为F6-3），用燕麦液体培养基培养，制成放线菌悬浮液。选择抑制效果最好的2株细菌，分别为蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus，编号为C3-5）、球形赖氨酸芽孢杆菌（Lysinibacillus sphaericu，编号为C5-3），用牛肉膏蛋白胨液体培养基培养，制成细菌悬浮液。

1.1.2 培养基[7] 液体燕麦培养基：燕麦片 30 g、水 1 000 mL；固体燕麦培养基：在液体燕麦培养基中加琼脂 20～25 g；液体牛肉膏蛋白胨培养基（NA）：牛肉膏 3～5 g、蛋白胨 10 g、NaCl 5 g、蒸馏水 1 000 mL；固体牛肉膏蛋白胨培养基：在液体牛肉膏蛋白胨培养基中加琼脂 20～25 g。

1.1.3 试区概况及供试品种 试验在麻江县杏山镇麒麟村烟田中进行，海拔930 m，常年连作烟草，烟草青枯病发生严重，供试烟草品种为南江3号（中感青枯病）。

1.2 方法

1.2.1 供试菌液制备方法 用灭菌竹签挑取放线菌在固体燕麦培养基上扩大培养，于28 ℃培养箱培养7 d后，用直径为5 mm的打孔器打取放线菌的菌碟，取5个菌碟置于装有300 mL液体燕麦培养基的500 mL三角瓶中，于28 ℃恒温摇床振荡培养4 d可获得放线菌悬浮液。

用接种环挑取细菌于5 mL的无菌水中，混匀。用移液枪吸取0.1 mL菌液分散地放于NA平板上，用无菌玻璃涂棒在培养基表面轻轻地涂布均匀，约20 min后，倒置于32 ℃培养箱培养3 d后，用直径为5 mm的打孔器打取细菌的菌碟，取5个菌碟置于装有300 mL NA液体培养基的500 mL三角瓶中，于32 ℃恒温摇床振荡培养4 d后即可获得细菌悬浮液。

1.2.2 田间设置 试验共设6个处理，处理一：含F4-3；处理二：含F6-3；处理三：含C3-5；处理四：含C5-3；处理五：40%硫酸链霉素（2 000倍稀释液，药剂对照）；处理六：清水（空白对照）。每处理3个重复，共计18个小区，随机区组排列。每小区种有烟株82穴，每个小区之间和田边都留出一行做为保护行。

2011年4月30日移栽烟苗，移栽前先用拮抗放线菌或细菌的液体培养液浸根40 min后再移栽，移栽完毕后，每株烟苗再用生防菌悬浮液40 mL+清水160 mL混合液浇根。之后每隔20 d浇灌1次，每株烟苗使用40 mL生防菌悬浮液浇灌，整个烟株生长期共浇灌3次。药剂对照和空白对照的浸根、灌根时间、次数相同。于2011年6月30日处理完毕。

1.2.3 田间病害调查 以整株为单位，于2011年6月20日进行第一次调查，整个试验阶段共调查3次，间隔时间10 d。病害分级标准依据全国烟草行业烟草病害调查分级标准YC/T39-1996进行[8]。0级：全株无病；1级：茎部偶有退绿条斑，或（和）半数以下叶片或顶叶轻度凋萎；2级：茎部有明显黑色条斑但尚未达到植株顶部，或（和）病侧半数以上叶片或部分腰叶以上叶片凋萎；3级：茎部黑色条斑达到植株顶部，或病侧叶片全部凋萎，或全株大部分叶片凋萎；4级：病株枯死。

1.2.4 数据统计、分析方法[9]

发病率=（发病株数/调查总株数）×100%

病情指数=∑（各级病株或叶数×该病级值）/（调查总株或叶数×最高级值）×100endprint

相对防效=（对照区病情指数-处理区病情指数）/对照区病情指数×100%

采用Excel软件计算发病率、病情指数、相对防效；DPS数据处理系统分析平均相对防效之间的显著性差异。

2 结果与分析

2.1 拮抗放线菌、细菌田间试验结果

第一次调查的时间为烟苗移栽后的50 d，之后每隔10 d调查一次，共调查3次。将这3次对烟草青枯病害调查的数据单独统计，计算出3个重复小区的平均发病率、病情指数和相对防效。不同处理对烟草青枯病菌的防治效果见表1。由表1可知，①从2株放线菌的防治效果上看，与清水以及处理五相比，都表现为不同程度的防治作用。3次调查的结果都表明处理二的发病率始终是最低、病情指数最小、相对防效是最好的。②从2株细菌的防治效果上看，与清水以及处理五相比，也都表现为不同程度的防治作用。同样3次调查的结果都表明处理四的发病率始终是最低、病情指数最小、相对防效是最好的。③从2株拮抗放线菌与2株拮抗细菌的防效对比上看，处理二的效果最好。则3次调查的相对防效平均值由大到小依次为处理二（63.65%）、处理四（60.03%）、处理三（43.85%）、处理一（41.76%）、处理五（17.11%）。④从处理五与清水处理对比上看，施用处理五的烟株，对烟草青枯病的防治略微有效，但是防效不明显。⑤从不经过任何处理的对照组的数据上分析，其发病率随时间推移越来越大，到了后期高达63.38%，这说明了该地块的烟草青枯病发病非常的严重，损失相当的大。

2.2 相对防效的差异显著性分析

由表2可知，试验的4株生防菌中对烟草青枯病的防效与处理五相比均有极显著差异。处理二与处理四3次调查表明没有显著或极显著差异，但处理二的防效略高于处理四；处理一在第一次调查时防效极显著高于处理三，但是另外两次调查防效均没有显著差异。由此可知，防治效果由高到低依次是处理二 、处理四 、处理三、处理一、处理五。

综上所述，2株拮抗放线菌和2株拮抗细菌的田间防治效果由大到小依次为F6-3、C5-3、C3-5、 F4-3。

3 小结与讨论

1）采用平板对峙法筛选出的2株拮抗放线菌和2株拮抗细菌，不仅平板上的抑制效果明显，且田间中的防治效果也显著。其相对防效均明显好于硫酸链霉素，且效果较稳定。由此可见，烟草根围土壤中的拮抗放线菌和拮抗细菌能够较好地与病原菌竞争，从而达到防治病害发生的作用。特别是土壤中的链霉菌属和芽孢杆菌属的菌株。

2）田间试验效果表明，粉红孢类群玫瑰暗黄链霉菌（S. roseofulvus，编号为F6-3）的防效最好。2株拮抗细菌也表现出较好的防治效果，且细菌的繁殖速度快，培养周期短。

3）本研究是对拮抗菌悬浮液的原液进行了田间测定，还需在不同的浓度梯度上进行试验，进一步筛选出最佳的浓度，为提高这4种生防菌的利用价值提供出参考。

参考文献：

[1] 张 薇.烟草青枯菌拮抗放线菌的筛选、鉴定及发酵条件研究[D]. 山东泰安：山东农业大学，2009.

[2] SALANOUBAT M， GENIN S，ARTIGUENAVE F，et al. Genome sequence of the plant pathogen Ralstonia solanacearum[J].Nature，2002，415（6871）：497-502.

[3] GREY B E，STECK T R. The viable but nonculturable state of Ralstonia solanacearum may be involved in long-term survival and plant infection[J]. Applied and Environmental Microbiology，2001，67（9）：3866-3872.

[4] 霍沁建，张 深，王若焱.烟草青枯病研究进展[J].中国农学通报，2007，23（8）：364-368.

[5] COOK K J，BAKER K F. The nature and practice of biologicalcontrol of plant pathogens[M].USA：APS Press，1984.

[6] CHEF I. Innovative approaches to plant disease control[M].New York：Wiley，1987.

[7] 方中达.植病研究方法[M].北京：中国农业出版社，1998.

[8] 孔凡玉，赵廷昌，张成省，等.防治烟草青枯病生防菌筛选及田间防治试验研究[A].成卓敏.农业生物灾害预防与控制研究[C].北京：中国农业出版社，2005.

[9] 陈敦德，熊尚玖，李宗友.农作物病虫害统计方法及应用[M].成都：四川科学技术出版社，1989.endprint