鼠神经生长因子对糖尿病大鼠皮肤损伤的促愈合作用

徐江平，郭海彪，汪海涛，吴金刚，王灿茂，甘丹娜，程玉芳

(1广东省新药筛选重点实验室，广东广州510515;2南方医科大学药学院，广东广州510515)

自发性皮肤溃疡或皮肤创面难愈是糖尿病常见的一类慢性并发症。糖尿病是以持续病理性高血糖为基本生化特征的代谢性疾病［1］。“微环境污染”假说认为:糖尿病代谢紊乱所致的皮肤组织局部高糖和晚期糖基化终末端产物(advanced glycation end production，AGE)蓄积引起的皮肤微环境改变是导致糖尿病创面难愈的始动因素之一［2］。有研究表明，局部高糖和AGE 蓄积可使组织细胞、细胞外基质、生长因子等发生改变［2］。生长因子是一类具有刺激细胞生长活性的细胞因子，参与维持皮肤组织代谢及调控创面修复的各个阶段［2］。高糖环境可诱导生长因子蛋白发生糖基化改变，进而导致糖尿病患者皮肤中正常功能活性的生长因子缺失［2］。因此外源性补充生长因子有助于促进糖尿病患者创面的修复［3－4］。

鼠神经生长因子(mNGF)是从小鼠颌下腺中提取纯化的神经生长因子［5］，为神经生长因子家族一员，具有修复神经损伤的功能。现阶段商品化注射液已经取得国家批文并在临床上得以应用。本实验旨在探究mNGF 是否具有促进糖尿病大鼠皮肤损伤愈合的作用。

1 材料与方法

1.1 实验药品

mNGF 注射液，舒泰神(北京)生物制药股份有限公司，生产批号:Y20121101;外用冻干重组人酸性成纤维细胞生长因子(商品名:艾夫吉夫)，上海万兴生物制药有限公司，批准文号:国药准字 S20060102，执行标准:YBS01812006，规格:25000IU/支。

1.2 实验动物

180 ～220 g 雄性SD 大鼠120 只，由上海西普尔－必凯公司提供，许可证号:SCXK(沪)2013－0016。实验全程在广州中医药科大学科技产业园有限公司SPF 级动物房中进行，大鼠单笼饲养，每天接受12 h 光照/黑暗循环，可自由摄食饮水。

1.3 大鼠糖尿病(I 型)皮肤损伤模型的制备

1.3.1 大鼠糖尿病(I 型)模型制作方法

大鼠适应饲养3 d 后开始制备模型。链脲霉素1 g/支+缓冲液(0.1 mol/L 柠檬酸+0.1 mol/L 柠檬酸三钠，pH =4.5)14.2 mL，大鼠按体重0.1 mL/100 g 静脉注射，给药剂量为70 mg/kg，每天1 次，连续2 d。自第2 次注射后第3 d、第6 d 检查血糖，以血糖≥11.1 mmol/L 为 I 型糖尿病合格模型。血糖仪(OneTouch UltraEasy，上海强生)测量范围(血糖仪最大显示范围33.4 mmol/L)显示为“H”(所有显示为H 的血糖值按照33.4 mmol/L计算)。

1.3.2 皮肤缺损模型制备

大鼠用戊巴比妥纳45 mg/kg 腹腔注射麻醉，背部用脱毛剂脱毛，在背部一侧做一个直径1.8 cm(面积等于2.54 cm2)圆形标记，用碘伏皮肤消毒后沿标记线将全层皮肤切除，创面按压止血，暴露治疗，单笼饲养。

1.3.3 皮肤烫伤模型制备

大鼠用戊巴比妥纳45 mg/kg 腹腔注射麻醉，背部用脱毛剂脱毛，用YLS5Q 型烫伤仪选直径1.8 cm 探头在背部烫出深II 度烫伤创面(烫伤条件为:烫头温度85 ℃;压力0.5 kg;时间为10 s)。

1.4 分组与给药

将造模成功的大鼠分为5 组，分别为空白对照组、阳性对照组(90 U/cm2)、mNGF 给药组(3，6，12 μg /kg)，每组12 只。创面形成当天开始治疗，肌肉注射相应药物，每天1 次，连续治疗21 d。

1.5 观测指标

1.5.1 实验观察

观察治疗后第3，7，10，14 和21 d 大鼠皮肤创面愈合率和创面面积。

1.5.2 病理检查

实验结束后每组取3 只动物皮肤，制病理片，HE 染色观察创面中成纤维细胞、纤维细胞、胶原纤维细胞和毛细血管生长情况，并采用半定量化的方法进行评分。评分标准:± 表示无增殖(0 分);+ 轻度增殖(1 分);+ + 明显增殖(2 分);+ + +增殖非常明显(3 分)。

1.6 统计方法

治疗后伤口面积经图像处理系统计算后用均数±标准差(x ± s)表示，与模型对照组同时间点进行等方差组间两样本均数比较的t检验统计分析，P ＜0.05 定为显著性差异统计学意义。

2 实验结果

2.1 糖尿病模型成模情况

连续2 d 链脲霉素腹腔注射后，糖尿病大鼠根据血糖水平分层随机分组，每组大鼠均为12 只，I 型糖尿病大鼠血糖水平见表1。

表1 I 型糖尿病大鼠血糖水平 mmol/L

2.2 mNGF 对糖尿病大鼠皮肤缺损性损伤的促愈合作用

大鼠在伤口刚形成后2 ～3 d 精神差，活动少，随后精神状态和进食恢复正常，大部分实验动物从创面形成当天到治疗结束，伤口表面干燥无渗出，无化脓溃烂现象。与治疗前比较(0 d)，糖尿病大鼠经mNGF 7 d 给药后，创面的绝对面积显著性缩小，模型组创面较治疗前缩小了仅16.7%，而mNGF 低、中、高3 个治疗组的创面面积比治疗前分别缩小31.5%，26.3% 和29.5%。但随着治疗时间的延长，mNGF 不同剂量在第14 d 和21 d 对缺损性损伤大鼠皮肤愈合作用十分有限，说明mNGF 对早期缺损性皮肤损伤具有一定的促愈合作用，mNGF 对糖尿病大鼠皮肤缺损性损伤的治疗作用见表2。

表2 mNGF 对糖尿病大鼠皮肤缺损性损伤的治疗作用(±s)

表2 mNGF 对糖尿病大鼠皮肤缺损性损伤的治疗作用(±s)

治疗时间/d不同组别的创面面积/cm 2模型对照组阳性对照组低剂量组中剂量组高剂量组0 2.51 ±0.282.53 ±0.182.79 ±0.352.59 ±0.362.78 ±0.31 3 2.46 ±0.22 1.99 2.22 ±0.34 12.3 2.74 ±0.54 1.79 2.41 ±0.45 6.95 2.71 ±0.42 2.52 7 2.09 ±0.62 16.7 1.54 ±0.59 39.1 1.91 ±0.65 31.5 1.91 ±0.65 26.3 1.96 ±0.50 29.5 101.22 ±0.63 51.4 0.98 ±0.44 61.3 1.11 ±0.59 60.2 0.70 ±0.13 73.0 1.17 ±0.57 57.9 140.42 ±0.18 83.3 0.35 ±0.18 86.1 0.50 ±0.18 82.1 0.36 ±0.17 86.1 0.52 ±0.33 81.3 210.38 ±0.18 85.7 0.25 ±0.18 90.1 0.34 ±0.22 87.8 0.32 ±0.19 87.6 0.49 ±0.31 82.4

2.3 mNGF 对糖尿病大鼠皮肤烫伤性损伤的促愈合作用

mNGF 对糖尿病大鼠皮肤深II 度烫伤的治疗作用见表3。与模型组比较，治疗组大鼠创面面积也是在治疗第7 d 开始缩小，而且随着治疗时间的延长，治疗组创面愈合的速度明显比模型组快。由表3 可以看出，模型对照组治疗第7，10，14 和21 d 创面面积与治疗前比较分别缩小了8.27%，24.8%，39.0% 和61.0%;而mNGF 高剂量组同时间点创面面积缩小分别为 21.7%，36.2%，50.4% 和80.3%，与模型组比较，mNGF 治疗组创面面积明显减小(P ＜0.05 ～0.01)，同时在mNGF低、中、高3 个剂量组之间有显著的量效关系存在，说明mNGF 对促进糖尿病大鼠皮肤烫伤的愈合有非常明显的作用。

表3 mNGF 对糖尿病大鼠皮肤深II 度烫伤的治疗作用(±s)

表3 mNGF 对糖尿病大鼠皮肤深II 度烫伤的治疗作用(±s)

注:与空白对照组比较* P ＜0.05，＊＊P ＜0.01，＊＊＊P ＜0.001。

治疗时间/d不同组别的创面面积/cm 2空白对照组阳性对照组低剂量组中剂量组高剂量组0 2.54 ±0.002.54 ±0.002.54 ±0.002.54 ±0.002.54 ±0.00 3 2.46 ±0.39 3.15 2.20 ±0.34 13.4 2.42 ±0.29 4.72 2.42 ±0.58 4.72 2.33 ±0.28 8.27 7 2.33 ±0.40 8.27 1.77 ±0.27＊＊30.3 2.15 ±0.24 15.4 1.88 ±0.26*26.0 1.99 ±0.19*21.7 101.91 ±0.26 24.8 1.60 ±0.23*36.6 1.74 ±0.14 31.5 1.66 ±0.18*34.7 1.62 ±0.14*36.2 141.55 ±0.30 39.0 0.90 ±0.24＊＊＊64.5 1.36 ±0.26 46.5 1.28 ±0.17*49.6 1.26 ±0.13*50.4 210.99 ±0.32 61.0 0.49 ±0.20＊＊80.7 0.58 ±0.29*77.2 0.61 ±0.37*76.0 0.50 ±0.16＊＊80.3

2.4 mNGF 对糖尿病大鼠皮肤损伤后组织修复的影响

糖尿病大鼠皮肤切割损伤经mNGF 治疗21 d后，病理评分量化结果如表4所示。空白组的真皮层新生毛细血管数量较少，组织间隙少量充血，成纤维细胞和纤维细胞数量较少［6－7］，胶原纤维较少(如图1a所示);阳性组的真皮层中毛细血管丰富，毛细血管周围散布大量成纤维细胞，纤维细胞数量较少，胶原纤维较多(如图1b所示)。mNGF 低剂量组的真皮内毛细血管较多，毛细血管周围散布大量成纤维细胞，纤维细胞数量较少，胶原纤维数量较多(如图1c所示)。mNGF 中剂量组的真皮内有大量毛细血管，毛细血管周围散布大量成纤维细胞，纤维细胞数量较多，胶原纤维丰富(如图1d所示)。mNGF 高剂量组的真皮内有大量毛细血管，毛细血管周围散布少量成纤维细胞，纤维细胞数量较少，胶原纤维丰富(如图1e所示)。

表4 mNGF 对糖尿病大鼠皮肤缺损性损伤治疗后病理评分表

图1 mNGF 治疗糖尿病大鼠皮肤切割损伤后的真皮病理组织变化

糖尿病大鼠皮肤深II 度烫伤经mNGF 治疗21 d 后，病理评分量化结果如表5所示。空白组的真皮内少有毛细血管，成纤维细胞和纤维细胞数量较少，胶原纤维数量较多(如图2a所示);阳性组的真皮内含有大量毛细血管，毛细血管周围散布大量成纤维细胞和纤维细胞，胶原纤维丰富(如图2b所示)。mNGF 低剂量组的真皮含有大量毛细血管和成纤维细胞，少量纤维细胞，胶原纤维丰富(如图2c所示)。mNGF 中剂量组的真皮内含有大量毛细血管，毛细血管周围成纤维细胞、纤维细胞数量较少，胶原纤维丰富(如图2d所示)。mNGF 高剂量组的真皮内毛细血管数量和成纤维细胞较少，纤维细胞数量较多，胶原纤维丰富(如图2e所示)。

表5 mNGF 对糖尿病大鼠皮肤深II 度烫伤治疗后病理评分表

图2 mNGF 治疗糖尿病大鼠皮肤深II 度烫伤的真皮病理组织变化

3 讨论

糖尿病患者常存在诸多并发症，其中自发性皮肤溃疡或皮肤创面难愈是较为常见的一类，不仅发病率高，而且治疗困难。糖尿病患者皮肤内源性生长因子缺乏，生长刺激功能不足。研究证实，重组人酸性成纤维细胞生长因子(rhaFGF)能显著性促进糖尿病大鼠难愈性皮肤溃疡愈合［8］。因此，本研究采用rhaFGF作为阳性对照药，探讨同为生长因子的mNGF对糖尿病大鼠皮肤损伤的促愈合作用。

链脲霉素具有细胞毒性，可损伤胰岛B 细胞，使体内胰岛素合成受损，常用于糖尿病模型的建造［9］。本研究采用皮肤切割损伤(清洁创面)和皮肤烫伤(有腐烂组织创面)2 种模型来模拟糖尿病患者的难愈性皮肤溃疡［10］。两者虽然损伤方式不同，但有一个共同点，即难愈，且都能模拟临床糖尿病慢性溃疡的组织病理学改变及损伤修复进程，因此能更全面地对mNGF 的促愈合作用进行评价。

研究表明，皮肤损伤后愈合过程为:创缘表皮基底细胞开始大量增生，沿创口边缘向中心延伸，同时刺激周围成纤维细胞和内皮细胞增生，新生毛细血管出现，并在创伤底部及其边缘形成肉芽组织［11－12］。因此本研究以成纤维细胞、纤维细胞、胶原纤维细胞和毛细血管生长情况作为观察指标，评价mNGF 对糖尿病皮肤损伤的促愈合效果。

本研究发现，mNGF 对糖尿病大鼠皮肤切割性损伤后的纤维细胞和毛细血管增生有明显促进作用。这与有关aFGF 促进成纤维细胞增殖和新生血管生成的报道结果相一致［4］。然而mNGF 对糖尿病大鼠皮肤切割性损伤创面面积的愈合并无明显作用。因此，mNGF 对于缺损性皮肤损伤的作用可能在早期治疗中效果更为明显。

mNGF 对糖尿病大鼠皮肤烫伤有显著的促愈合作用，具体表现为:显著性缩小烫伤创面面积，增加烫伤局部成纤维细胞、纤维细胞、胶原纤维、毛细血管数量，且存在一定的剂量依赖性。研究证实rhaFGF 能促进烫伤愈合，且能增加烫伤局部成纤维细胞、纤维细胞、胶原纤维、毛细血管数量［10］。因此推测mNGF通过增加糖尿病烫伤局部成纤维细胞、纤维细胞、胶原纤维、毛细血管数量来促进糖尿病烫伤皮肤的愈合。

综上所述:mNGF 对大鼠皮肤损伤后的纤维细胞和毛细血管增生有明显促进作用，对糖尿病大鼠皮肤烫伤创面有显著的促愈合作用。本研究为mNGF 应用于临床治疗糖尿病皮肤溃疡，包括促进皮肤切割性损伤、皮肤烫伤的愈合提供了有力的依据。

［1］陆树良，青春，谢挺，等.糖尿病皮肤“隐性损害”的机制研究［J］.中华创伤杂志，2004，20(8):468－473.

［2］Lu S L，Xie T，Niu Y W.A potential mechanism for impaired wound healing－cutaneous environmental disorders in diabetes mellitus［J］.Zhonghua Shao Shang Za Zhi，2008，24(1):3－5.

［3］余尚昆，黄晓元，张胜南.bFGF 对大鼠创面血管生成及愈合的影响［J］.医学临床研究，2005，22(5):595－597.

［4］刘青，郭蔚莹，刘克辉，等.重组人酸性成纤维细胞生长因子对糖尿病大鼠难愈性皮肤溃疡的促愈合作用［J］.吉林大学学报(医学版)，2007，33(1):61－63.

［5］王南卜，曹梦函.脑源性神经营养药物的临床应用［J］.中国药物经济学，2012(4):102－104.

［6］顾邵.魔芋葡甘聚糖—透明质酸共混膜防治硬膜粘连的实验研究［D］.昆明:昆明医科大学，2012.

［7］马慧.弱激光促进糖尿病大鼠模型皮肤创伤愈合的实验研究［D］.天津:天津医科大学，2012.

［8］刘炘，马嵘，马珂，等.重组人酸性成纤维细胞生长因子对创面愈合的作用［J］.中国药科大学学报，2008，39(1):87－90.

［9］Okizaki S，Ito Y，Hosono K.Suppressed recruitment of alternatively activated macrophages reduces TGF－β1 and impairs wound healing in streptozotocin－induced diabetic mice［J］.Biomed Pharmacother，2015，70(3):17－25.

［10］Huang Z，Lu M，Zhu G.Acceleration of diabetic－wound healing with PEGylated rhaFGF in healing－impaired streptozocin diabetic rats［J］.Wound Repair Regen，2011，19(5):633－644.

［11］赵新才.法医学伤残评定［M］.成都:四川大学出版社，2003:55－57.

［12］王冰玲.A 型肉毒毒素(BTXA)对兔耳增生性瘢痕作用的实验研究［D］.昆明:昆明医科大学，2013.