G蛋白门控的内向整流钾通道在中枢神经系统中的调控机制及功能研究进展＊

杨 锐， 贾 强， 马善峰， 郭晓磊， 高 琴， 刘小粉

综述

G蛋白门控的内向整流钾通道在中枢神经系统中
的调控机制及功能研究进展＊

杨 锐， 贾 强， 马善峰， 郭晓磊， 高 琴， 刘小粉△

蚌埠医学院生理学教研室，蚌埠 233030

GIRK通道； G蛋白； 钾通道； 中枢神经系统

钾离子（K＋）通道是细胞膜上种类最多，分布最广的一类特殊的蛋白质微孔道。在兴奋性细胞中，它们与细胞体积调节、细胞激素分泌、细胞膜电位的形成以及电脉冲的产生都有着密切的关系。所有的K＋通道都有一个保守的选择性过滤器，允许K＋通过，而不允许Na＋通过。K＋流依电化学梯度的方向，通过孔道被动地流入或流出细胞。对于大多数的K＋通道，给定一个相等但方向相反的梯度，K＋流在任一方向都表现出同样的动力学效应。而某些K＋通道，对K＋内流的通透程度大于外流的通透程度，这种现象称为内向整流，这类K＋通道被命名为内向整流钾（inwardly rectifying potassium，Kir）通道。

在哺乳动物细胞和植物细胞中发现了许多具有内向整流特点的钾通道［1－2］。到目前为止，有15个Kir基因被分离出来，并根据其特点及氨基酸序列，将Kir基因分成7个亚家族:Kir1.x～Kir7.x。根据通道的功能特点，归纳为4种功能性通道:经典的Kir通道（Kir2.x），G蛋白门控的Kir通道（Kir3.x），ATP敏感的Kir通道（Kir6.x）和钾离子转运通道（Kir1.x，Kir4.x，Kir5.x和Kir7.x）。其中，G蛋白门控的内向整流钾（G protein-gated inwardly rectifying potassium，GIRK）通道在各种组织中的分布较为广泛，在中枢神经系统的作用尤为重要，因此，本文将重点介绍GIRK通道在中枢神经系统中的研究进展。

1 GIRK通道的结构

GIRK家族共有5个不同亚基（GIRK1～5），其中GIRK5在非洲爪蟾的卵母细胞中表达［3］。GIRK1～4（Kir3.1～3.4）在哺乳动物组织中表达，分别由基因KCNJ3、6、9、5编码。免疫共沉淀的结果显示，GIRK通道通常是以四聚体的形式存在，由4个亚基结合形成具有功能的同源或异源四聚体的通道［4］。但GIRK1与其他亚基不同，它有内质网滞留信号，因此需要与其他GIRK亚基共表达才能定位到细胞膜上，形成具有功能的四聚体通道［5］，如GIRK1和GIRK2，GIRK1和GIRK3，GIRK1和GIRK4形成的功能性的异源通道。GIRK2既可以和其他GIRK亚基组成异源四聚体，也可以形成具有功能的同源四聚体通道。生物化学和分子遗传实验表明，GIRK通道在大脑中的主要形式是由GIRK1和GIRK2亚基组成的异源四聚体［6］。

GIRK亚基具有与其他Kir亚基相似的结构特征:有2个跨膜结构域TM1和TM2，由细胞外通道孔区（H5）相连，胞质内有COOH-末端和NH2－末端。H5区域作为“离子选择性过滤器”，和其他的K＋选择性离子通道共同拥有T-X-G-Y（F）-G的特征序列。由于GIRK通道结构缺乏电压感受器区域，所以GIRK通道对膜电压不敏感。

GIRK通道的C末端具有2个Gβγ结合位点，同时具有蛋白激酶A（PKA）的磷酸化位点；在N端也有一个Gβγ结合位点［7－8］。根据GIRK通道的晶体结构分析显示，其有2个K＋门:一个是由胞质侧的TM区的螺旋束交叉形成，另一个是位于胞质孔道的质膜处的环，称为G-环［9］，均允许K＋通过。

2 中枢神经系统中GIRK通道的调控

GIRK通道的活性和功能受到精确的调控，调控的机制主要包括通道的定位，亚基与亚基的相互作用，以及通道的调控因子。下面将重点介绍细胞内分子对GIRK通道的调控。

2.1 Gβγ亚基

对GIRK通道的研究最早是在心肌细胞的KACh通道上进行的，KACh通道是由GIRK1和GIRK4亚基组成，只有在胞质内存在GTP时，ACh才能激活KACh通道，并且百日咳毒素（Pertussis Toxin，PTX）可以抑制这种效应［10］。此外，膜片钳实验也证实，加入GTP的非水解类似物GTPγS可以持续地激活KACh通道［11］。以上研究证明对PTX敏感的G蛋白（Gi／o）是GIRK通道重要的激活因子。

G蛋白是鸟苷酸结合蛋白的简称，是G蛋白偶联受体（G-protein coupled receptor，GPCR）联系胞内信号通路的关键膜蛋白。G蛋白是由α、β和γ三个亚单位构成的异三聚体。Gα具有结合GTP或GDP的能力，又具有GTP酶的活性；而β和γ亚单位通常形成功能复合体发挥作用。在没有激动剂与GPCR结合的时候，Gα结合GDP，Gαβγ复合物附着在GPCR上，GTPase活性很低。当激动剂与GPCR结合时，加快GDP／GTP的转换速率，使Gβγ和Gα分离，分别激活相应的效应器，调控细胞的生理功能。

虽然Gβγ和Gα都可以调控多种效应器例如腺苷酸环化酶和磷脂酶，但到底是Gα还是Gβγ激活GIRK通道的呢？现在大量的研究已经证实，GIRK通道只能被Gβγ激活［12－14］。通过酵母双杂交实验和电生理实验可证实:Gβγ是结合在GIRK通道亚基的NH2和COOH末端的［15］。在对G蛋白不敏感的Kir2.1上通过杂交插入GIRK1的COOH末端会引起由Gβγ导致的通道激活。利用构建自GIRK2和IRK1的嵌合体和点突变体，发现GIRK通道上C端结构域中的βL-βM环是Gβγ激活GIRK通道的重要结构［16］。Gα虽然对GIRK通道有调控作用，但是不能激活GIRK通道［17］。

2.2 G蛋白信号调节蛋白

1996年，Dohlman等在酵母中发现的G蛋白信号调节蛋白（regulator of G protein signaling，RGS）是G蛋白信号传导的负调节子。RGS是细胞内GTP酶激活蛋白，可以加速Gi／oα亚基水解GTP，限制G蛋白激活的强度和持续时间，使GIRK电流快速失活［18］。Chuang等［19］观察到RGS蛋白可以提高GIRK通道激活的起始速度。在非洲蟾蜍的卵母细胞表达系统中，RGS缩短了GIRK通道失活的时间进程，也可以加快神经递质激活GIRK通道的时间、加大GIRK电流的幅度［20］。

RGS调控GIRK通道的机制之一，是RGS和GIRK通道形成了大分子复合物。在小鼠神经元上，RGS家族成员（RGS7）与5型的Gβ亚基（Gβ5）形成复合物，结合到GIRK通道上，加快了与GABAB受体的偶联，确保了神经细胞上G蛋白信号的高时间分辨率［21］。

2.3 PIP2

4，5-二磷酸磷脂酰肌醇（PIP2）是膜锚定的磷脂，在细胞膜磷脂中的含量不足1%，但在许多细胞进程中起重要作用，例如产生第二信使，即二酰基甘油和三磷酸肌醇，调节细胞内生物反应。近来的研究发现，PIP2本身就可以直接调控许多转运蛋白，如激活Kir通道、Na＋／H＋交换蛋白、钙激活的Na＋通道等［22］。

1998年，Huang等［23］利用非洲爪蟾卵母细胞表达体系，发现在没有添加Gβγ的情况下，PIP2本身就可以激活GIRK通道，只是速度较慢；而添加Gβγ，PIP2激活GIRK通道的速率大大提高。因此认为Gβγ对GIRK通道的激活效应是通过稳定PIP2和GIRK通道之间的相互作用而实现的。Sui等［24］在非洲爪蟾的卵母细胞中表达GIRK1／4通道，首次从单通道水平上研究PIP2对GIRK通道的调节作用。实验提示，Gβγ激活GIRK通道必须依赖胞内ATP的水解，而PIP2模拟了ATP的作用。若将胞内的PIP2耗竭，会阻碍Gβγ对GIRK通道的激活效应，因此认为，PIP2可能是Gβγ介导的信号转导通道的控制点。

PIP2是维持大多数Kir功能所必需的。从亲代细胞上分离下来的膜片，Kir通道活性在逐渐下降。这种“用完”的活性可以利用在细胞膜表面添加ATP来恢复，利用磷脂激酶的作用补充PIP2。

2.4 蛋白激酶C

Sharon等［25］利用非洲爪蟾卵母细胞表达体系，研究代谢型谷氨酸受体对GIRK通道的抑制作用时，发现激活代谢型谷氨酸受体可以激活Gq蛋白和磷脂酶C（phospholipase C，PLC），从而抑制GIRK通道。而这种抑制作用可以被广谱的蛋白激酶抑制剂和选择性的蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）抑制剂阻断。这些结果提示了PKC可能参与对GIRK通道的调控。Hill等［26］在爪蟾卵母细胞上表达了GIRK1、GIRK4、Ml型毒蕈碱受体和D2型多巴胺受体，他们认为Ml受体对GIRK通道的抑制作用是通过PKC引起的磷酸化而产生的。加入PKC抑制剂可以减少毒蕈碱受体的抑制作用，直接激活PKC可以完全消除毒蕈碱受体的抑制作用。GIRK通道受到细胞膜机械拉伸的影响，但是这种影响是依赖于PKC的。其可能的机制是，当细胞膜拉伸时，机械牵张首先激活PLC，PLC又将膜上的PIP2水解成二酰基甘油（DAG）和1，4，5-三磷酸肌醇，DAG协同Ca2＋又激活下游的PKC，PKC通过正反馈再次增强了PIP2的水解。当膜上的PIP2减少时，GIRK通道和PIP2的作用会受到抑制，因而GIRK通道的活性受到抑制［27］。

2.5 乙醇

当体内乙醇浓度达到18mmol／L或血液中乙醇浓度达到0.08%时，乙醇可以直接激活GIRK通道［28］。Federici等［29］利用细胞内电生理技术（电流钳和单电极电压钳），观察在大鼠中脑多巴胺能神经元上，乙醇对GABAB介导的抑制性突触后电位的影响，发现在中脑的腹侧被盖区（ventral tegmental area，VTA）神经元，乙醇激活了GABAB受体下游的GIRK通道，增强了GIRK电流。Aryal等［30］研究发现，在细胞质区域的两个相邻的GIRK亚基之间的接口处，形成了乙醇口袋的结构。乙醇口袋是由3个突出的结构元件构成:N-末端结构域、一个亚基的βD-βE环和相邻亚基的βL-βM环。通过GIRK2中的乙醇口袋的氨基酸位点定向突变，证明了乙醇口袋是GIRK2通道的乙醇依赖性激活的位点。

2.6 其他物质对GIRK通道的调控

在Mg-ATP存在的条件下，GIRK通道可以被毫摩尔级的细胞内Na＋激活［24］。通过抑制钠钾泵的活性，升高胞内Na＋（Nai＋）浓度，同样可以开放GIRK通道。除了细胞内Na＋以外，在海马神经元中，发现一个对精神兴奋剂敏感的分选蛋白27（sorting nexin 27，SNX27）同样可以调控GIRK通道，参与调节神经元细胞的兴奋性［31］。此外，GIRK通道也可以被细胞内酸化所抑制，细胞内pH的敏感性依赖于胞质区域的N-端和C-端的组氨酸残基［17，32］。

3 GIRK通道在中枢神经系统中的分布及生理功能

在哺乳动物中枢神经系统中，GIRK通道的分布非常广泛，并且可以被多种神经递质及其受体激活，包括乙酰胆碱、腺苷、ATP、多巴胺、GABA、阿片肽、5-羟色胺、去甲肾上腺素和生长抑素等，通过慢突触后抑制维持静息电位以及调节神经元的兴奋性。在大脑中，4种GIRK亚基均有表达，GIRK1～GIRK3亚基的分布较为广泛，且交错分布，在嗅球、海马、皮层、丘脑和小脑内均高水平表达［33］；而GIRK4亚基的分布相对比较局限，仅在嗅球、皮层及海马等少数区域表达［34］。GIRK通道生理功能的改变与严重的脑疾病的病理生理学相关联，如成瘾、癫痫、帕金森病和共济失调、唐氏综合征［35－36］。

3.1 GIRK通道在海马区中的分布和功能

海马区，是脑颞叶内的一个部位，是大脑边缘系统的重要组分，主要负责学习和记忆。在海马组织中，GIRK亚基的分布非常广泛，在齿状回、CA1、CA2和CA3均有表达。GIRK1～GIRK3的总体分布非常相似，均高水平表达。在大鼠的所有发育阶段，海马中GIRK1、GIRK2和GIRK3的表达都很丰富，但存在结构差异，在CA1、CA3和齿状回的分子层表达最高，齿状回门区表达最低［37］；且主要在颗粒细胞和锥体细胞上表达［33］。

利用免疫组化及电子显微技术等研究未成年以及成年的小鼠和大鼠GIRK1～GIRK3亚基的时间和空间上的表达，发现在所有年龄段动物的海马中，GIRK1～GIRK3亚基的总体分布很相似，亚基蛋白水平随着动物年龄的增长而增长，并伴随着亚细胞定位的转变。在大鼠发育早期（即出生后第5天），GIRK亚基主要定位在锥体细胞的内质网上，但到60日龄时，GIRK亚基大多定位在细胞质膜上。并且在突触的发育过程中，GIRK1和GIRK2主要位于突触后位点，而GIRK3主要位于突触前位点［37］。虽然GIRK4在海马中表达很少，但是研究发现，GIRK4敲除的小鼠在空间学习和记忆方面的能力会受到损伤［38］。

GIRK2参与了海马突触可塑性以及空间学习记忆行为。Ts65Dn，一种唐氏综合征小鼠模型，在研究其发病的分子机制时，发现GIRK2在Ts65Dn的大脑海马区域过量表达，并且这种过量表达会引起额叶皮层中的GIRK1蛋白水平增高。而在Ts65Dn的海马和前脑皮层中，GIRK1／GIRK2通道的过表达会削弱兴奋性的输入，调节受影响区域的动作电位发放频率和突触动力学［39］。因此，含GIRK2亚基的GIRK通道在Ts65Dn以及唐氏综合征的神经生理学表型上起重要作用。

3.2 GIRK通道在小脑中的分布和功能

原位杂交技术显示，GIRK1、GIRK2和GIRK3 mRNA在小脑中均有表达［5］。在小脑的分子层，GIRK1在大鼠出生后5d，表达水平较低；在10d时表达量增加；在15d时开始降低直到成年。相反的，GIRK1在颗粒细胞层的表达是稳步上升的。GIRK2在出生后5d时，在分子层和颗粒层的表达最高，然后表达量降低直到成年期［37］。

GIRK1和GIRK2在小脑中的表达最为丰富，且在颗粒细胞中的表达最高；GIRK3主要在篮细胞和浦肯野神经元中与其他GIRK亚基共表达；GIRK4在小脑的少数区域内表达，如高尔基细胞中表达GIRK2／4通道。在小脑中，GIRK1、GIRK2和GIRK3，这3个亚基的表达是相互影响的，如果其中任何一个亚基的基因被敲除，都会影响其他2个亚基的表达；而GIRK4的基因若被敲除，却并不影响GIRK1、GIRK2和GIRK3的表达，这可能与小脑内GIRK4的分布区域相对局限有关［5］。

神经元上的GIRK通道通常参与调节神经递质对突触后的抑制效应。利用双标记的免疫荧光技术和电镜技术，观察到在小脑中GIRK通道主要也是分布在突触后位点。然而，在小脑中的一些区域，如苔藓纤维，GIRK通道也存在于突触前位点，主要是在谷氨酸神经元的轴突末端［5］。但是对GIRK2基因敲除和GIRK2／GIRK3双基因敲除小鼠的功能研究，发现GIRK通道对许多神经递质引起的突触前抑制没有效果［40］，可能突触前抑制主要是由G蛋白依赖的电压门控Ca2＋通道活性抑制引起的［41］。

GIRK通道在神经元的发育中起重要作用，若小鼠小脑的GIRK2发生点突变（G156S），则小鼠成为Weaver小鼠，表现为不育，并且伴有自发性癫痫。GIRK2敲除的小鼠，其GIRK1的表达也会降低，也有自发性癫痫发作，并且在药物的诱导下更容易发生癫痫［42］。

电生理研究已经证明在小脑的多种神经元中均存在GIRK电流，但是在不同类型的神经元上，GIRK通道的电生理特性、Gβγ调控的敏感性以及特异性神经递质的相关受体都是不同的。可能是因为在小脑中，GIRK通道可以被不同的G蛋白偶联的抑制性受体激活，如GABAB受体、腺苷A1受体、代谢型谷氨酸受体等，因此表现出不同的效应。但是，小脑中GIRK通道的很多生理功能还没有弄清楚，需要更多的研究去阐述。

3.3 GIRK通道在中脑核团中的分布和功能

黑质和腹侧被盖区（VTA）是中脑的神经核团，尽管脑内大部分的神经元都表达GIRK1、2和3，但是在黑质和VTA中的多巴胺神经元上的GIRK通道均不表达GIRK1，它们主要是由GIRK2和 GIRK3组成的。与含有GIRK1的GIRK通道相比，GIRK2／3通道对Gβγ亚基的敏感性较低，这可能会导致多巴胺系统中药物奖赏回路输出量的改变［6］。

在中脑的多巴胺神经元中，GIRK通道的缓慢激活是由多巴胺D2受体介导的。此外，GIRK通道的激活也可以由GABAB受体介导。在脑片的研究中发现，多巴胺神经元的突触后膜均表达GABAB受体和GIRK通道。GIRK通道不仅参与了GABAB受体介导的突触后抑制，调节突触后神经元的兴奋性；也参与了GABAB受体介导的突触前抑制，调节突触前神经递质的释放。因此，GIRK通道不仅可以抑制突触前释放，也可以引起突触后超极化，调节细胞的兴奋性。

神经元GIRK通道参与了药物滥用和成瘾。多巴胺可以激活起源于VTA的脑边缘系统，是产生强迫成瘾行为的重要因素。所有成瘾的药物都对脑边缘多巴胺系统起作用。γ-羟基丁酸（γ-hydroxybutyric acid，GHB）——低亲和力的GABAB受体的激动剂，首先与GABAB受体结合，激活GIRK通道，最终产生成瘾效果。而巴洛芬（Baclofen）——同样是GABAB受体的激动剂，也激活GIRK通道，最终产生的是对滥用药物具有抗渴求效应。这个区别可能是因为在VTA处，GIRK1、GIRK2和GIRK3亚基的组合方式不同，形成了不同的GIRK通道，进而引起的药理学效应也不相同［6］。

4 结语

近年来，随着分子生物学技术的不断发展，GIRK通道调控的研究亦越来越深入，大量的晶体结构被解析出来，人们对GIRK通道的门控机制有了进一步的了解。GIRK通道在中枢神经系统中的分布非常广泛，但是对其功能的研究还不够全面，尤其对大脑皮层，虽然也有GIRK通道的高表达，但是与功能相关的文献却较少。深入掌握GIRK通道在中枢神经系统中的生理学意义，将有助于了解一些神经性疾病的发病机制，并给临床上的针对性治疗提供理论依据。

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（2014-12-26 收稿）

R329.251

10.3870／j.issn.1672-0741.2015.03.028

＊安徽省教育厅自然科学研究项目（No.2011SQRL083ZD，KJ2013B146），蚌埠医学院科研项目（No.BY0907，BYKY1312，Bykf13A06）

杨 锐，女，1982年生，理学硕士，讲师，E－mail:xzxyr＠sina.com

△通讯作者，Corresponding author，E-mail:xfenr＠163.com