甜茶素对棕榈酸诱导INS-1细胞超微结构及Cyt C易位表达的保护作用

郑华，计可为，周莲清，孟春梅，苏志恒*

(1.广西医科大学医学科学实验中心,广西　南宁　530021；2.广西医科大学药学院药物分析教研室，广西　南宁　530021)

甜茶素对棕榈酸诱导INS-1细胞超微结构及Cyt C易位表达的保护作用

郑华1，计可为2，周莲清2，孟春梅1，苏志恒2*

(1.广西医科大学医学科学实验中心,广西南宁530021；2.广西医科大学药学院药物分析教研室，广西南宁530021)

【摘要】目的：探索甜茶素对棕榈酸诱导INS-1细胞损伤的保护机制。方法：MTT法检测正常对照组、棕榈酸模型组、不同浓度甜茶素组细胞存活率，透射电镜观察各组细胞超微结构，免疫电镜观察各组细胞色素C的易位表达。结果：不同浓度甜茶素对棕榈酸诱导的INS-1细胞具有保护作用，超微结构保存较好；模型组细胞凋亡增多且超微结构损伤严重，Cyt C蛋白从线粒体释放入细胞质。结论：甜茶素可以提高棕榈酸诱导INS-1损伤的细胞存活率，抑制细胞凋亡的发生，其机制可能与抑制棕榈酸引起的氧化应激和阻碍Cyt C从线粒体转位入细胞质，激活细胞凋亡蛋白酶级联反应有关。

【关键词】甜茶素；棕榈酸；INS-1细胞；超微结构；细胞色素C

广西甜茶(RubussuavissimusS.Lee)为蔷薇科悬钩子属多年生有刺灌木，民间主要用于糖尿病和肥胖症的治疗，甜茶素是甜茶叶中最具价值的成分[1-2]。近年有研究报道[3]胰岛素抵抗导致的血脂水平紊乱可使胰岛β细胞处于持续的氧化应激状态，最终可导致胰岛β细胞凋亡。有研究表明，甜茶素能显著降低高脂饮食模型大鼠血糖水平[4]，但具体作用机制尚未见文献报道。基于此，我们以棕榈酸模拟机体胰岛素抵抗所导致的高血脂产生的内环境改变，并应用透射电镜和免疫电镜技术，观察甜茶素干预大鼠胰岛细胞瘤细胞INS-1后亚细胞超微结构及细胞色素C(Cytochrome C,Cyt C)表达的影响，探讨甜茶素抑制脂毒性的作用机制，为开发防治糖尿病新药提供依据。

1材料与方法

1.1细胞株大鼠胰岛细胞瘤INS-1细胞购自中国医学科学院基础医学细胞中心，资源编号为3111C0001CCC000378。

1.2药物与试剂棕榈酸、甜茶素(Sigma公司)；DMEM培养基、胎牛血清(Gibco公司)；兔抗Cyt C多克隆抗体(美国Santa Cruz公司)；羊抗兔IgG胶体金10nm(武汉博士德生物试剂有限公司)；LR White树脂(英国RESIN公司)；其余试剂均为分析纯。

1.3仪器CO2培养箱；-20℃，-80℃冰箱(日本Sanyo公司)；UC6徕卡超薄切片机；紫外线聚合箱(中镜科仪公司)；H-7650透射电子显微镜(日本日立公司)。

1.4细胞模型的建立和实验分组取生长状态良好的INS-1细胞接种于96孔培养板，每孔200μl，含3×104个细胞，置于CO2培养箱中培养24h后，加入无血清培养液，继续培养3h，使各孔细胞同步化。按随机原则分为6组：①正常对照组，不加任何处理因素；②棕榈酸模型组：在细胞培养基中加入终浓度为0.5mmol/L棕榈酸培养48h；③甜茶素干预组：在细胞培养基中先加入不同浓度(25、50、100、200μmol/L)的甜茶素培养48h，再加入终浓度为0.5mmol/L棕榈酸继续培养48h。每组均设3个复孔。

1.5细胞存活率的检测细胞存活率应用MTT法检测，实验结束前4h加入MTT(5g/L，每孔20μl)继续孵育4h后，弃培养液，每孔加入DMSO 150μl，振荡5min，使结晶物充分溶解，选择492nm的波长，用酶联免疫检测仪测各孔吸光值(A)，记录结果。计算存活率=(实验组A值/阴性对照组A值×100%)。

1.6透射电子显微镜观察细胞超微结构收集各组细胞，离心成团，经3%戊二醛前固定，锇酸后固定，乙醇梯度脱水(50%、70%、80%、90%、)，乙醇丙酮1∶1(浓度为90%)脱水，100%丙酮脱水3次，用618包埋剂、DDSA、DBP、DMP-30调和剂渗透包埋，烘箱烤制(38℃ 12h，45℃12h，60℃48h)，超薄切片，醋酸铀、枸橼酸铅分别染色5min，日立H-7650电镜下观察。

1.7免疫电镜观察Cyt C蛋白的分布收集各组细胞离心成团，于4%多聚甲醛-0.5%戊二醛固定2h之后，4%甘氨酸封闭醛基30min，-20℃下依次30%、50%、70%乙醇脱水，在-20℃冰箱中依次用LR White树脂+加速剂：70%乙醇(2∶1)、100%LR White树脂渗透，再用100%LR White树脂渗透过夜。在4℃下用纯的LR White树酯包埋，在-20℃冰箱中用长紫外线(360nm)照射聚合72h，然后在室温下继续照射聚合48h。超薄切片，用镍网捞片。对超薄切片进行封闭非特异性结合的处理，室温下5min，然后依次加入一抗孵育过夜，二抗胶体金孵育2h，经PBS漂洗后常规染色，干燥待镜。

2结果

2.1甜茶素对INS-1细胞存活率的影响

表1　 不同浓度甜茶素对棕榈酸诱导的细胞生存率的影响　±s)

注：与空白对照组比较，*P<0.01；与棕榈酸组比较，#P<0.05。

2.2各组INS-1细胞超微结构改变由图1可知，正常对照组INS-1细胞胞质见丰富的粗面型内质网及核糖体，内见多个胰岛素分泌颗粒，线粒体膜完整，嵴清晰，核染色质分布均匀。棕榈酸组INS-1细胞胞质线粒体肿胀疏松化、嵴断裂，空泡样变明显，粗面内质网扩张严重，核糖体脱落，细胞核碎裂、核溶解，核染色质边集，凋亡小体生成，胰岛素颗粒分泌减少；甜茶素50μmol/L组INS-1细胞胞质内粗面型内质网及核糖体较丰富，可见较多胰岛素分泌颗粒，核膜完整，核染色质分布较均匀，未见凋亡小体；甜茶素25μmol/L和100μmol/L组可见INS-1细胞粗面型内质网基本正常，个别线粒体嵴不完整，胰岛素分泌颗粒较多，未见凋亡小体，与棕榈酸模型组比较，各用药组INS-1细胞超微结构均有不同程度的改善。

2.3Cyt C蛋白在INS-1细胞中的分布由图2可知，正常对照组可见INS-1细胞线粒体内可见大量Cyt C蛋白表达，表现为有大量簇状黑色胶体金颗粒分布于线粒体膜旁，而棕榈酸模型组INS-1细胞线粒体里几乎看不见胶体金颗粒，与正常对照组相比差异具有统计学意义(P<0.05)。相反，棕榈酸模型组INS-1细胞在线粒体外的细胞质内可见较多胶体金颗粒，与正常对照组相比差异有统计学意义(P<0.05)。甜茶素各剂量组INS-1细胞线粒体内可见较多胶体金颗粒，线粒体外的细胞质有少量胶体金颗粒，与棕榈酸模型组相比差异有统计学意义(P<0.05)，其中以甜茶素50μmol/L组最为明显。

3讨论

研究发现氧自由基代谢参与了糖尿病的发生与发展，高糖高脂对胰岛β细胞有协同破坏作用，增高的血浆游离脂肪酸可导致细胞凋亡，这种由游离脂肪酸引起的细胞凋亡称为“脂性凋亡”[5]。脂毒性的细胞内环境产生过多的氧自由基，启动氧化应激反应，产生大量的凋亡刺激因子，造成胰岛细胞的不可逆凋亡。因此临床上必须重视脂毒性对胰岛细胞的损伤，寻找天然无毒的抗氧化剂，将有助于2型糖尿病的临床防治。广西甜茶(RubussuavissirnusS.Lee)是最高甜度、低热能且天然无毒的珍稀甜味植物，具有“药、糖、茶”三重功效，是一种获得美国FDA认证的天然的糖类替代品和药品。其主要成分甜茶素(rubusoside)是由斯替维醇和葡萄糖结合而成的四环二萜苷。现代研究表明，甜茶素有一定的降血糖、降血脂和降血压的作用，对肥胖症、糖尿病、心血管病、高血压等有一定疗效[6-8]。但以往的研究都是对模型动物来进行研究，并没有从亚细胞角度来深入探索甜茶素的作用机制。

线粒体是细胞内氧化磷酸化和合成三磷酸腺苷(ATP)的主要场所，为细胞的活动提供能量。外部因素的刺激可导致线粒体功能下降，呼吸链断裂，成为ROS生成的主要来源[9]。调控细胞凋亡有三种途径：线粒体途径、死亡受体途径和内质网途径。线粒体是多种促细胞凋亡信号转导分子的靶点，同时也是细胞死亡通路的整合元件，被称作细胞凋亡的生死开关，大多数凋亡刺激因子通过线粒体激活细胞凋亡途经[10]。因此，线粒体超微结构的改变和线粒体内的蛋白表达变化与细胞凋亡关系密切。Cyt C是线粒体呼吸链中的一种电子传递体，作为一种促凋亡信号蛋白，在细胞凋亡中发挥着重要的作用[11]。正常情况下，它存在于线粒体内膜和外膜之间的腔中，对线粒体能量代谢起着重要调节作用，凋亡信号刺激导致线粒体膜通透性的改变或者蛋白复合孔的形成，使其从线粒体释放至细胞胞浆，结合胞浆中的Apaf-1 (apoptoticprotease activating factor-1)后启动caspase级联反应：Cyt C/Apaf-1复合物激活caspase-9，后者再激活caspase-3和其它下游caspase，从而导致细胞凋亡。免疫电镜技术是免疫组织化学技术与电镜技术的结合，研究抗原抗体在亚细胞定位的技术。研究通过免疫电镜技术，发现在棕榈酸的作用下，INS-1细胞线粒体嵴断裂，空泡样变，Cyt C从线粒体转位进入细胞胞浆，从而启动一系列caspase级联反应，使INS-1细胞凋亡增加，而各剂量甜茶素组线粒体膜较完整，嵴基本完好，大部分Cyt C蛋白还是结合在线粒体上，没有观察到凋亡小体，其中以甜茶素50μmol/L组的保护作用最好。因此，研究认为甜茶素对INS-1细胞具有抗氧化保护作用，其机制可能为阻碍Cyt C从线粒体释放入细胞胞浆，阻止caspase级联反应的发生，减少细胞的凋亡。

内质网主要负责蛋白质的合成转运糖基化修饰以及Ca2+的储存与分布的信号转导，还参与类固醇激素的合成和糖类和脂类的代谢等。细胞在脂毒性产生的多种氧自由基和凋亡因子的刺激下，内质网腔内出现错误折叠与未折叠蛋白聚集以及Ca2+代谢紊乱而导致内质网稳态的破坏，称为内质网应激(endoplasmic reticulum stress，ERS)。研究发现，ERS在介导细胞损伤及凋亡中起重要作用，并可能与肥胖胰岛素抵抗及糖尿病的发生发展密切相关[12]。本研

究发现，棕榈酸模型组INS-1细胞内质网严重扩张，核糖体脱落，可见细胞体内产生了严重的内质网应激反应，未折叠蛋白增多、Ca2+超载，激活钙调蛋白calpain从而激活下游的caspase，引起INS-1细胞凋亡。在甜茶素各剂量组，内质网扩张的现象得到了改善，内质网的形态类似于正常的INS-1细胞，表明甜茶素可以逆转高脂状态对这些内质网的损伤，拮抗棕榈酸的氧化应激作用。

综上所述，研究以棕榈酸作用于体外培养INS-1细胞，模拟体内氧化应激导致的血脂代谢障碍产生的内环境改变，并应用甜茶素进行干预，发现甜茶素对棕榈酸干预下的胰岛细胞瘤INS-1细胞具有保护作用，最佳保护浓度为50μmol/L。其保护机制可能为阻碍Cyt C从线粒体转位入细胞胞浆，阻止caspase级联反应的发生。同时还发现脂毒性对INS-1细胞内质网系统破坏严重，而各剂量组的甜茶素均能够有效的保护内质网超微结构，这个过程中甜茶素是否逆转了内质网应激所产生的凋亡信号，值得进行下一步的研究。

参考文献

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Protective Effects of Rubusoside on the Ultrastructure and Cyt C Translocation

Expression of the Palmitic Acid-induced INS-1 Cells

ZHENG hua1,JI Kewei2,ZhouLianqing2,MENG Chunmei1, SU Zhiheng2*

1.Medical Scientific Research Center of Guangxi Medical University, Nanning 530021,China;

2.School of pharmaceutical science, Guangxi Medical University, Nanning 530021, China

Abstract:ObjectiveTo investigate the protective mechanism of Rubusoside treating on the palmitic acid-induced INS-1 cells.Methods MTT assay was used to detect the cell viability rate of control group, palmitic acid group and different concentrations of Rubusoside group.Transmission electron microscope(TEM) was used to observe the ultrastructur of every group and the immune electron microscopy was used to detect cytochrome C translocationexpression.Results As evidenced by MTT assay, the cell viability significantly was enhanced by different concentrations Rubusoside pretreatment. TEM revealed degenerative changes in the ultramicroscopic structure of palmitic acid-induced INS-1 cells whereas various concentrationpretreatment with Rubusoside could significantly attenuated the deterioration of the damage. Immune electron microscopy showed that different concentrations Rubusoside could prevent the cytochrome C releasing from mitochondria to cytoplasm with palmitic acid induced.Conclusion Rubusoside can improve the survival rate of palmitic acid-induced INS-1 cells and inhibit the occurrence of apoptosis.It is suggested that the mechanism may be associated with the inhibition of the oxidative stress induced by palmitic acid and prevent the cytochrome C releasing from mitochondrial to cytoplasm, which can activate caspase cascade and a downstream signaling to apopotosis.

Key words:Rubusoside;palmitic acid;INS-1 cell;ultrastructure;cytochrome C

(收稿日期：2015.09.07)

【中图分类号】R285.5

【文献标志码】A

【文章编号】1007-8517(2015)24-0016-04

作者简介：郑华(1980-)，女，汉族，医学博士，主要从事糖尿病天然药物代谢组学研究。通信作者：苏志恒(1981-)，男，汉族，生物学博士，副教授，主要从事药物代谢组学研究。E-mail:suzhiheng1981@126.com

基金项目：广西自然科学基金(2012GXNSFBA053108);广西医科大学“未来学术之星”大学生课外创新科研课题(WLXSZX16022);广西医科大学青年基金(GXMUYSF18)。