不同宫内缺氧时程对胎鼠脑组织STAT3表达的影响

陈　滟　曹　兵　王国栋　杨恩彬　丛树园　陈　普*

1.云南中医学院，云南　昆明　650500；2.云南省第二人民医院，云南　昆明　650200

不同宫内缺氧时程对胎鼠脑组织STAT3表达的影响

陈滟1曹兵2王国栋1杨恩彬1丛树园1陈普1*

1.云南中医学院，云南昆明650500；2.云南省第二人民医院，云南昆明650200

【摘要】目的：研究不同宫内缺氧时间对胚胎大鼠脑组织信号转导子与转录激活子3蛋白表达的影响。 方法：制备乏氧性缺氧动物模型，从胎龄15d到16d连续宫内缺氧2d，分别缺氧2、4、6、8、12h共5个不同时程，采用免疫组化检测胚胎大鼠脑组织STAT3蛋白表达情况。结果：与对照组比较，缺氧2h胎鼠脑组织STAT3蛋白表达升高(P<0.05)，在缺氧6h达最高(P<0.05)；缺氧8h较对照组染色增强，但较缺氧6h表达减弱(P<0.05)；缺氧12h组与对照组相比STAT3表达降低(P<0.05)。结论：短时缺氧(缺氧2、4、6、8h)能增强胎鼠脑组织STAT3蛋白的表达，但缺氧时间较长(缺氧12h)会降低STAT3蛋白的表达，说明宫内缺氧对胚胎脑组织的影响可能通过STAT3通路进行调节。

【关键词】STAT3；缺氧；胚胎；脑组织

胎儿窘迫是胎儿宫内缺氧危及胎儿健康和生命的综合征，常发生在临产或妊娠后期，是未生儿死亡的主要原因。神经组织对缺氧较为敏感，胎儿窘迫可引起严重的神经系统后遗症。研究表明，信号转导与转录激活因子3(signal trnasducer and aetivator of tnarscription 3，STAT3)参与多种基因的表达和调控，并与其他转录因子一起形成复杂的调控网络参与到胚胎的神经系统发育过程[1]。在局部脑缺血再灌注的研究中发现，缺血缺氧可激活神经元STAT3的表达[2]。陈良万等[3]研究缺血性脑损伤发现，通过调节JAK2-STAT3可以减轻脑损伤。研究观察宫内不同缺氧时间对胚胎神经组织STAT3蛋白表达的影响，以探讨STAT3在胎儿窘迫脑损伤中的作用。

1材料与方法

1.1动物与试剂云南系健康成年雌性SD大鼠30只(体重250~300g)，由昆明医科大学实验动物中心提供。STAT3免疫组织化学检测试剂盒(武汉博士德生物有限公司)。

1.2仪器泵吸式红外二氧化碳检测仪；JZ80-二氧化碳检测仪；奥林巴士显微镜。

1.3动物模型的建立将30只成年雌性大鼠分别与雄鼠配种，于第二日早晨发现雌鼠阴栓记为妊娠0d，至孕15d。将孕鼠随机分为：对照组、缺氧2h组、缺氧4h组、缺氧6h组、缺氧8h组、缺氧12h组，每组各5只(每只孕鼠可得胎鼠5~8只，每小组均随机选10只胎鼠)。将缺氧组各孕鼠放入装有300ng石灰(可吸收CO2)的4000ml容量的玻璃缸内，密闭瓶盖(广口瓶下端通过活塞连接氧气袋，活塞与氧气袋之间有约50ml容量的小气囊)。玻璃缸内还连接有测氧仪，使缸内O2浓度维持在10%~11%。当O2浓度降低时，通过活塞将小气囊中氧气缓慢挤压入玻璃缸内，维持O2浓度恒定。如此反复，直至孕鼠持续低张性缺氧达所需时程取出。孕16d相同操作至缺氧时间，取出复氧2h。然后将各孕鼠脱颈处死，快速剖腹取出胎鼠，取胎鼠脑放入10%甲醛固定。对照组孕鼠不缺氧直接取胎鼠脑组织固定。

1.4免疫组化每组每只孕鼠随机选2只胎鼠脑组织作常规石蜡切片(冠状切，片厚4μm)。选三张连续切片进行HE染色和免疫组化染色。显微镜下观察、照相、图像分析。

2结果

2.1显微观察情况胎鼠脑组织STAT3免疫组织化学检测阳性结果为细胞质内棕黄色颗粒，主要分布在前脑泡和脑室的室管膜细胞；前脑泡分化为端脑的区域可见阳性实心细胞条带，并在脑泡边缘可见阳性神经上皮细胞层；一些切片可在端脑内见到阳性细胞呈团块状分布；眼泡也有阳性表达。由图1~6可知，各组间STAT3的阳性表达差异较大。对照组室管膜细胞胞质的STAT3阳性表达较弱，缺氧2h组STAT3的阳性表达较对照组颜色明显增强；缺氧4h组阳性区域颜色与缺氧2h组差别不大，但面积增加；缺氧6h组STAT3的棕黄阳性结果最深，而缺氧8h组STAT3的阳性表达较缺氧6h组明显下降，但与对照组比较差别不大；缺氧12h组几乎没有STAT3的表达。

2.2观密度值情况由表1可知，与对照组比较，缺氧2h胎鼠脑组织STAT3蛋白表达升高(P<0.05)，在缺氧6h达最高(P<0.05)；缺氧2h组和缺氧4h组STAT3的蛋白表达无组间差异；缺氧6h组比缺氧4h组STAT3的表达增强，组间差异有统计学意义(P<0.05)；缺氧8h较对照组染色增强，但较缺氧6h表达减弱(P<0.05)；缺氧12 h组与对照组比较，STAT3表达降低(P<0.05)。

表1 各组STAT3免疫组化阳性OD值

组别OD组别OD对照组0.121±0.097缺氧6h组0.182±0.105△★缺氧2h组0.153±0.053△缺氧8h组0.132±0.087△▲缺氧4h组0.167±0.112△缺氧12h组0.099±0.023△●

注：与对照组比较，△P<0.05；与缺氧4h比较，★P<0.05；与缺氧6h比较，▲P<0.05；与缺氧8h比较，●P<0.05。

3讨论

星懿展在研究靶向STAT3基因干扰对小鼠神经干细胞增值分化影响发现，抑制神经干细胞中的STAT3基因可以降低神经干细胞的增殖活性，提示STAT3参与与胚胎神经干细胞的增殖分化。胎儿宫内窘迫的神经损伤与神经干细胞的增殖和分化密切相关。本研究组早期研究宫内缺氧对胎鼠神经干细胞的影响发现：宫内缺氧3、6、9h能刺激神经干细胞增殖，而宫内缺氧12h减少神经干细胞的数量[4]。这与本实验STAT3的变化呈现一致性，缺氧2h、4h、6h、8h能增强胎鼠脑组织STAT3蛋白的表达，但缺氧12h会降低STAT3蛋白的表达。提示宫内缺氧对胚胎神经干细胞的影响可能通过调节STAT3通路发挥作用，但两者的相关性还需要进一步的证实。哺乳动物大脑发育过程中，大脑皮质、纹状体、基底前脑区和海马区均能检测到STAT3的表达，且大量定位于巢蛋白(nestin)阳性的NSC中，与NSC的标记物Nestin呈现时空共表达性[5]。STAT3表达的变化，除影响神经干细胞的增殖，还会影响神经元和神经胶质细胞。在胚胎发育过程中，STAT3的激活能促进星形胶质细胞的增殖[6]。敲除STAT3能够促使神经干细胞向神经元分化，抑制其生成胶质细胞的能力[7]。然而，成年海马区神经元再生依赖于STAT3的激活[8]，轴突损伤后STAT3的过表达激活可促进神经元的再生[9]。本研究为后续研究宫内缺氧神经组织STAT3变化与神经干细胞的增殖、分化关系；与神经元的变化关系；与神经胶质细胞的变化关系提供一定的研究思路。深入研究宫内窘迫神经损伤的STAT3分子作用机制，可加深对疾病的认识，为临床治疗提供新作用靶点，提供一定的研究基础。

参考文献

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[4]陈滟，曹兵，梅欣明，等.不同宫内缺氧时程对胎鼠神经干细胞增殖的影响及当归保护作用[J].时珍国医国药，2009,20(7)：1642-1644.

[5]De Fraja C，Conti L，Magrassi L，et al． Members of the JAK /STAT proteins are expressed regulated during development in the mammalian forebrain[J]．J Neurosci Res，1998，54 (3) : 320-330．

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The Influence of Intrauterine Hypoxia in Different Time on STAT3 of Rat Embryo Brain Tissue

CHEN Yan1CAO Bing2WANG Guodong1YANG Enbing1CONG Shuyuan1CHEN Pu1

1. Yunnan college of traditional Chinese medicine, Kunming 650500,China;

2.The Second People′s Hospital Of Yunnan Province, Kunming 650200,China

Abstract:Objective To study the effect of intrauterine hypoxia in different time on the expression of STAT3 in rat embryo Brain tissue. Methods Gestational age 15 to 16 days rats were used of intrauterine hypoxia animal models. And the time of hypoxia respectively were 2、4、6、8、12h in a day. The protein expression levels of STAT3 in the Brain tissue of rat embryos were detected by immunohistochemical. Results By comparing with the control group, the protein expression levels of STAT3 in the Brain tissue of rat embryos were increased from hypoxia 2h, reached the highest level at 6h and decreased at 12h(P<0.05). Conclusion Hypoxia 2、4、6h and 8h can enhance the expression of STAT3 in the Brain tissue of rat embryos. But hypoxia 12h reduce the expression of STAT3. STAT3 possibly plays an important action in Hypoxic ischemia encephalopathy.

Key words:STAT3；Hypoxia；Embryo；Brain Tissue

(收稿日期：2015.09.05)

【中图分类号】R693

【文献标志码】A

【文章编号】1007-8517(2015)24-0013-03

作者简介：陈滟(1976-)，医学硕士，讲师，主要从事发育神经生物学的研究。通信作者：陈普(1978-)，男，汉族，云南宣威人，高级实验师。主要从事民族医药研究及实验教学工作。E-mail:chenynkm@126.com