稳定表达人TMPRSS2蛋白质悬浮生长MDCK细胞系的构建

冯 磊， 吴培培， 褚 轩， 陈 丽， 王伟峰， 侯继波

(江苏省农业科学院/国家兽用生物制品工程技术研究中心，江苏 南京 210014)

目前采用连续传代细胞系，如MDCK细胞、Vero细胞等替代SPF鸡胚在生物反应器中进行禽流感病毒的大规模增殖制备是科研单位、兽用疫苗生产企业竞相开展的研究热点［1-3］。禽流感病毒表面的HA蛋白质与宿主细胞上病毒受体结合的先决条件是HA蛋白质在其碱性氨基酸(Lys或Arg)位点进行有效裂解，形成HA1蛋白质和HA2蛋白质，这二者之间由二硫键连接。HA1蛋白质负责识别宿主细胞膜上的糖链受体，HA2蛋白质的N端有一段融合肽负责病毒囊膜与宿主细胞膜的融合，在H+攻击下由病毒的M2蛋白质形成离子通道帮助病毒核酸向胞内释放，继而进入细胞核完成逆转录、复制、翻译表达等后续过程［4］。禽流感病毒能够在SPF鸡胚中增殖的一个重要原因就是鸡胚尿囊液中含有大量的蛋白酶，能够对病毒粒子表面的HA蛋白质进行裂解［5-6］。而禽流感病毒在体外培养的动物细胞，如MDCK细胞、Vero细胞中增殖一般都需要在病毒增殖过程中添加经TPCK处理的胰蛋白酶［7-9］。这种蛋白酶弱化了胰凝乳蛋白酶的活性，增强了对碱性氨基酸(如Arg、lys)位点的裂解能力，从而能够保证禽流感病毒HA蛋白质的正确裂解［10-11］。但外源蛋白酶的添加对宿主细胞的生长状态造成的影响是不可逆的，特别是病毒连续传代后的蛋白酶积累对宿主细胞生理状态影响极为严重，进而影响流感病毒的增殖效率。

如果流感病毒增殖细胞能稳定表达蛋白酶，并定位表达于细胞膜的外侧则可以省去添加外源的蛋白酶，既可完成对病毒粒子表面的HA蛋白质裂解，又不会对细胞自身产生影响。人Ⅱ型跨膜型丝氨酸蛋白酶(Type II transmembrane protease serines，TMPRSS)是新近发现的一类特殊蛋白酶，该蛋白质从N端往C端依次是胞内结构域(Cyto.D)、跨膜结构域(TM)、主干区(低密度脂蛋白A类受体区LDLRA、富含半胱氨酸的清道夫受体区SRCR、原结构域Pro)、消化结构域(Catalytic domain)［12］，其中跨膜区结合于细胞膜上，主干区和消化结构域则表达定位于细胞膜的外侧，具有对蛋白质消化酶解的功能［13］。TMPRSS2主要存在于前列腺中，最近也有报道称该蛋白酶在人类呼吸道上皮细胞中被发现［14］。如果我们在流感病毒增殖宿主细胞中重组表达该跨膜类蛋白酶，其本身并不释放到培养液中，只是消化结构域表达定位到细胞膜外侧，对其细胞本身不存在任何蛋白质消化作用，但可以对初始结合于细胞膜上的病毒粒子HA蛋白质进行有效酶解，进而提高病毒感染效率，增加病毒的增殖滴度。

本试验试图构建能够稳定表达人TMPRSS2蛋白质的重组MDCK细胞系，并且能够在生物反应器中实现对该重组细胞株的单细胞全悬浮培养，为禽流感病毒在动物细胞上更好地适应传代以及大规模制备禽流感疫苗的技术革新提供一条有效的新途径。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞、禽流感病毒、载体、抗体等生物材料单细胞悬浮培养的MDCK-Sus细胞由国家兽用生物制品工程技术研究中心对ATCC引进的贴壁生长MDCK细胞自行驯化适应并建系保藏。禽流感H9亚型病毒:A/chicken/Jiangsu/02/09(JS02)、A/chicken/Jiangsu/03/11(JS03)、A/chicken/JiaXing/02/11(JX02)、A/chicken/XiGang/04/01(XG04)、A/chicken/HangZhou/03/01 (HZ03)、A/chicken/HeNan/03/01(HN03)由国家兽用生物制品工程技术研究中心分离鉴定并保藏，真核细胞表达载体pIRES由国家兽用生物制品工程技术研究中心保藏，兔抗人TMPRSS2蛋白质的一抗购自Santa Cruz生物技术公司，FITC标记的羊抗兔IgG、HRP标记的羊抗兔IgG购自杭州联科生物技术公司。

1.1.2 主要生物试剂 Trizol、M-MLV逆转录系统、pMD19-T载体、oligo dT、各种限制性内切酶、Ex Taq酶、T4 DNA连接酶等分子生物学材料均购自TaKaRa公司。质粒大提试剂盒、核酸胶回收试剂盒等购自 Qiagen公司。DMEM、G418、Opti-MEM、PEI(25 000线性)试剂等购自Invitrogen公司。TPCK处理的胰蛋白酶、细胞悬浮生长培养基组分(大豆蛋白水解物、酵母提取物、转铁蛋白、激素、F-68等成分)购自Sigma公司。细胞膜蛋白质抽提试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 pIRES-TMPRSS2表达载体的构建 采用NheⅠ/XbaⅠ双酶切含有人TMPRSS2蛋白质ORF的质粒载体以及pIRES质粒，将TMPRSS2目的片段及pIRES质粒的骨架片段进行电泳后回收，定量后进行核酸片段连接，转化至DH5α中，挑选连接阳性菌落并大量扩增，质粒抽提后酶切验证重组真核表达载体pIRES-TMPRSS2。经质粒大提后获得转染用质粒。

1.2.2 G418作用浓度的筛选 MDCK-Sus细胞接种于50 ml TPP培养管(瑞士TPP公司，87050)中，其中培养体积为10 m1，初始细胞密度为1 ml 5×105个。在不同的培养管中加入不同浓度的G148，浓度 为 100 μg/ml、200 μg/ml、300 μg/ml、400 μg/ml、500 μg/ml、600 μg/ml、700 μg/ml、800 μg/ml，置于37 ℃、5%CO2，转速为 100 ～250 r/min培养摇床上进行悬浮培养，每日取样观察并测定细胞存活率，培养6～12 d，记录细胞死亡情况，确定G418的最小有效工作浓度。

1.2.3 阳离子聚合物介导的悬浮细胞转染 接种初始细胞密度为1 ml 5×105个的MDCK-Sus细胞株于50 ml TPP培养管中，悬浮培养过夜后用于质粒转染。转染前将悬浮培养用培养基更换为Opti-MEM培养基孵育10 min。以10 ml细胞悬液为1个转染单位，采用PEI试剂介导的转染方法进行MDCK-Sus细胞的悬浮转染操作，具体转染步骤见文献［15］。转染8 h后，以1 000 r/min离心3 min，将含有剩余转染复合物的培养上清液去除，更换成MDCK-Sus细胞株的正常悬浮培养基继续振荡悬浮培养。

1.2.4 MDCK-Sus-TMPRSS2 细胞克隆的筛选 转染后18～24 h的MDCK-Sus细胞株经离心回收按照1∶12的比例重新分散至15 ml新鲜悬浮培养液中培养，37 ℃、5%CO2，转速为 100 ～200 r/min，悬浮培养液中G418的工作浓度为300μg/ml，细胞初始密度大致为1 ml 1×105～3×105个。按照每5 d换1次液的频率进行G418持续筛选，第一轮筛选时间大致为3～4周。选择能够在有G418筛选压力下持续增殖的重组MDCK-Sus-TMPRSS2细胞克隆继续悬浮培养传代。该传代操作以离心去除培养上清液并重悬细胞沉淀来实现。第二轮筛选中将G418筛选工作浓度提高至600μg/ml继续加压筛选。最终获得能够在G418抗性筛选中稳定持续悬浮生长的重组MDCK-Sus-TMPRSS2细胞株。

1.2.5 RT-PCR、Western blot、间接免疫荧光鉴定将筛选出来的MDCK-Sus-TMPRSS2重组细胞株经离心收集，PBS清洗3遍后按Trizol法从细胞中抽提总RNA，具体方法参照Trizol试剂说明书。以oligo dT为逆转录引物按常规方法逆转录生成总cDNA后，以其为模板，进行PCR扩增。扩增引物为p1:5'-GGATGGCTTTGAACTCAGGGTCACC-3'，p2:5'-GGCATTAACCCTCACTAAAGGGAAG-3'，扩 增 程序如下:95℃ 3 min;98℃ 30 s，60℃ 35 s，72℃ 1 min，35个循环;72℃延伸10 min。

将筛选出来的MDCK-Sus-TMPRSS2重组细胞株经离心收集、PBS清洗3遍后用于膜蛋白质抽提。以5%浓缩胶和8%分离胶进行SDS-PAGE蛋白质电泳，采用半干式转膜操作将胶上蛋白质转移至PVDF膜上，经BSA封闭后，采用人TMPRSS2蛋白质的兔源一抗及HRP标记的羊抗兔二抗孵育有目的蛋白质的PVDF膜，采用DAB显色剂显色鉴定目的蛋白质表达情况。

将筛选出来的MDCK-Sus-TMPRSS2重组细胞株经离心收集分为两份，一份在96孔板中用于细胞静置培养，待细胞展开生长后固定并进行免疫荧光检测;另一份样品采用75%冷丙酮直接固定于96孔板中进行免疫荧光测定。以人TMPRSS2蛋白质的兔源一抗以及FITC标记的羊抗兔二抗进行检测，经PBS清洗3遍后在荧光显微镜下观察重组人TMPRSS2蛋白质在MDCK-Sus细胞上的表达情况。上述鉴定试验均以母本MDCK-Sus细胞为空白对照，按照相同操作步骤进行鉴定。

1.2.6 重组MDCK-Sus-TMPRSS2细胞悬浮培养及生长曲线测定 重组MDCK-Sus-TMPRSS2细胞以1 ml 3×105个的初始密度接种于250 ml的培养摇瓶中，放置于37℃、5%CO2，转速为120 r/min的培养摇床中进行种子细胞悬浮培养，以母本MDCK-Sus细胞为对照。在3 L生物反应器(荷兰Applikon公司产品)中，重组MDCK-Sus-TMPRSS2细胞以1 ml 3×105～5×105个的初始密度接种于1 600 ml初始培养体积中，设置培养转速60～180 r/min，培养温度37℃，溶解氧(DO)为50%，pH值为7.1，进行初始批式培养，培养96 h后进行补料培养，每24 h取样测定细胞密度，计算细胞比生长速率。

1.2.7 禽流感 H9亚型病毒在 MDCK-Sus-TMPRSS2细胞上的适应传代 在50 ml TPP细胞培养管中，以重组MDCK-Sus-TMPRSS2细胞、母本MDCK-Sus细胞为增殖细胞连续传代6株禽流感H9亚型病毒，每种病毒连续传15代，分别在第1、第5、第10、第15代测定增殖病毒的HA效价和半数组织培养物感染滴度，判断两种增殖宿主细胞对禽流感病毒的连续传代能力。仅母本MDCK-Sus细胞在连续传代增殖6株禽流感H9亚型病毒时添加2μg/ml的TPCK处理的胰蛋白酶。

1.2.8 AIV-H9亚型病毒HA效价及TCID50滴度的检测 采新鲜公鸡血，经抗凝处理及PBS清洗后制成0.5%鸡血球PBS液。在HA检测96孔板上以PBS连续对倍稀释病毒检测样品至第11孔，第12孔以PBS作为对照。每孔分别加入25μl 0.5%鸡血球PBS液，在振板器上振动10 s，室温下作用30～40 min。依据血球凝集程度判定反应结果，以出现完全凝集的最大稀释度为该病毒样品的血球凝集效价(HA titer)。

含有10%血清正常培养的MDCK细胞在96孔板中长至单层时接入连续10倍稀释的禽流感病毒样品，每个稀释度接入8孔，每孔200μl病毒稀释液，病毒稀释液中含有0.5%的血清和5μg/ml的TPCK处理的胰蛋白酶。3 d后检测每孔培养上清液的HA效价，有HA效价即判定该孔为阳性，纪录每个稀释度的阳性孔数，按照Reed-Muench方法计算病毒滴度，以1 ml lg TCID50来表示。

2 结果

2.1 pIRES-TMPRSS2载体的酶切验证

利用2个酶切位点将目的片段连入真核表达载体中，获得pIRES-TMPRSS2真核表达载体用于后续转染试验。NheⅠ/XbaⅠ双酶切pIRES-TMPRSS2载体鉴定结果显示，目的片段大小为1 492 bp，质粒载体骨架片段大致5 500 bp，大小正确，如图1所示。经质粒大提获得质量较高的质粒，OD260/OD280的值为1.81，用于后续质粒转染试验。

图1 重组pIRES-TMPRSS2载体的NheⅠ/XbaⅠ双酶切电泳鉴定Fig.1 Double enzymatic digestion of recombinant plasmidp IRES-TMPRSS2 with NheⅠ/XbaⅠ

2.2 MDCK-Sus-TMPRSS2重组细胞的克隆、筛选及鉴定

转染后的细胞在300μg/ml G418筛选环境中经过28 d的筛选，获得了能够正常持续悬浮生长的重组细胞株。将存活的细胞株分散至含有600μg/ml的G418筛选TPP培养管中继续加压筛选，最终获得能够持续生长的MDCK-Sus-TMPRSS2重组细胞。

经RT-PCR检测发现重组MDCK-Sus-TMPRSS2细胞株可扩增出1 500 bp左右的特异条带，与目的条带大小一致，而母本MDCK-Sus细胞的扩增结果为阴性，如图2所示。Western blot检测发现重组MDCK细胞株表达了分子量为53 000的目的蛋白质，而母本MDCK-Sus细胞无目的蛋白质表达，如图3所示。经间接免疫荧光检测，悬浮生长的重组细胞株可以表达人TMPRSS2蛋白质，如图4A所示。同时静置培养该细胞，使其贴壁生长后，再用间接免疫荧光也可检测出人TMPRSS2蛋白质的特异性表达(图4B)，而对照母本细胞未见特异性荧光，如图4C所示。

图2 TMPRSS2蛋白质的RT-PCR鉴定结果Fig.2 Identification of TMPRSS2 by RT-PCR

图3 MDCK细胞中TMPRSS2蛋白质的Western blot检测Fig.3 Detection of TMPRSS2 in MDCK cells by Western blot

2.3 MDCK-Sus-TMPRSS2重组细胞的悬浮生长性能

重组MDCK-Sus-TMPRSS2细胞的悬浮生长曲线如图5所示。与母本MDCK-Sus细胞比较，重组MDCK-Sus-TMPRSS2细胞的生长速率基本无变化，在250 ml摇瓶中培养细胞获得最大的细胞密度为1 ml 2.7 ×106个，平均比生长速率为 0.438 d－1，基本与母本细胞没有差异(母本细胞最大细胞密度1 ml 2.65×10个，平均比生长速率为0.453 d )，说明经过外源基因转染及筛选操作后获得的重组细胞生长性能基本没有发生变化。

图4 TMPRSS2蛋白质的间接免疫荧光(IFA)检测Fig.4 Identification of TMPRSS2 expression by IFA

图5 MDCK-Sus-TMPRSS2细胞与母本MDCK-Sus细胞悬浮生长曲线Fig.5 Suspension growth curves of MDCK-Sus-TMPRSS2 cells and parental MDCK-Sus cells

为了验证该重组MDCK-Sus-TMPRSS2细胞是否具备大规模悬浮生长的能力，在3 L生物反应器中对该重组细胞进行了分批(0～96 h)和补料式(96～168 h)联合培养，培养周期可以达到144～168 h，在培养后期经补料培养后的最大细胞密度可达到1 ml 6.83×106个(图 6)，同时细胞存活率始终保持在92%以上，说明该重组细胞株有望在种子细胞培养阶段和病毒培养阶段均可以保持较好的悬浮生长性能，有利于禽流感病毒在生物反应器中的大量增殖。

2.4 不同AIV-H9亚型病毒在重组MDCK-Sus-TMPRSS2细胞上的连续传代培养

图6 MDCK-Sus-TMPRSS2细胞在3 L反应器中悬浮生长曲线Fig.6 Suspension growth curve of MDCK-Sus-TMPRSS2 cells cultured in 3-L bioreactor

结果如表1所示，在不使用TPCK处理的胰蛋白酶条件下，重组MDCK-Sus-TMPRSS2细胞可以正常增殖6株禽流感H9亚型病毒，且利用该重组细胞进行禽流感病毒连续传代时可以逐步提高病毒的增殖效率，在连续盲传10代后，子代病毒的血凝效价仍保持较高的水平。母本MDCK-Sus细胞在2μg/ml TPCK处理的胰蛋白酶条件下连续增殖该6株禽流感病毒5代，增殖效率与重组细胞株的增殖效率差异不大，但连续增殖10代后，其子代病毒的血凝效价逐步降低，无法获得理想的增殖效果。重组MDCK-Sus-TMPRSS2和母本MDCK-Sus细胞在连续盲传15代JS03株禽流感病毒接毒后，母本MDCK-Sus细胞在接毒24 h后就呈现出细胞边缘毛糙皱缩现象，病毒增殖后期呈现出细胞裂解不完全的现象，病毒增殖效率不佳。MDCK-Sus-TMPRSS2细胞在接毒后24 h，细胞边缘清晰;病毒增殖后期细胞感染充分，裂解完全(图7)。

表1 不同AIV-H9亚型病毒在2种MDCK细胞上的连续传代培养Table 1 AIV-H9 virus adaptation in MDCK-Sus-TMPRSS2 cells and MDCK-Sus cells to several passages

图7 JS03株在重组MDCK-Sus-TMPRSS2细胞和母本MDCKSus细胞连续盲传禽流感病毒JS03株15代后的细胞形态Fig.7 The morphologies of MDCK-Sus-TMPRSS2 and MDCK-Sus cells after AIV-JS03 strain adaptation to 15 passages

在6株禽流感H9亚型毒株的连续传代15代后，检测其病毒的半数组织培养物感染滴度，结果(图8)显示，通过重组MDCK-Sus-TMPRSS2细胞增殖的6株病毒均可获得较高的病毒滴度，均高于1 ml 4.5lg TCID50，说明病毒经重组 MDCK-Sus-TMPRSS2细胞连续盲传后子代病毒粒子具有较好的感染性。由母本MDCK-Sus细胞连续盲传的子代病毒滴度均低于1 ml 3.5lg TCID50，说明经母本MDCK-Sus细胞连续盲传的子代病毒的感染能力明显下降。

图8 禽流感病毒在重组MDCK-Sus-TMPRSS2细胞和母本MDCK-Sus细胞中连续盲传15代后的滴度Fig.8 AIV titers adapted in MDCK-Sus-TMPRSS2 and MDCK-Sus cells to 15 passages

3 讨论

2010年 Bottcher-Friebertshauser报道，在重组MDCK细胞中经强力霉素诱导表达的TMPRSS2蛋白酶可裂解细胞内新合成的流感病毒HA蛋白质，同时也可以裂解被吞入胞内尚未被蛋白酶裂解的流感病毒HA蛋白质，提高了流感病毒增殖滴度［16］。在人肺变型病毒(HMPV)的增殖宿主Vero细胞中重组表达TMPRSS2蛋白质可有效切割该病毒F蛋白质，实现该病毒的高效增殖［17］。在冠状病毒(SARS-CoV)的增殖试验中发现，在受体细胞表面成功表达TMPRSS2蛋白质将有效酶解SARS病毒的S蛋白质，大大增加因该病毒感染而造成的合胞体的形成比例［18］。在PEDV的增殖过程中也发现，宿主细胞重组表达TMPRSS2蛋白质同样增强了对病毒Spike蛋白质的裂解能力，进而增强了病毒感染宿主细胞及子代病毒粒子向胞外释放的比例［19］。在我们的试验中，利用PEI这种阳离子聚合物介导将人TMPRSS2蛋白质表达载体悬浮转染至母本MDCK-Sus细胞中，从而获得了重组MDCK-Sus-TMPRSS2细胞。该重组细胞可以在不添加TPCK处理的胰蛋白酶条件下连续盲传适应6株H9亚型禽流感病毒，有效增殖获得子代禽流感病毒。且在盲传代次较高的情况下，仍然可以正常完成病毒的增殖过程，病毒增殖适应良好，表现出较高的HA效价和半数组织感染滴度。而在对照母本MDCK-Sus细胞中，病毒的增殖适应随盲传代次提高而逐渐下降，这可能是由TPCK处理的胰蛋白酶积累，从而影响宿主细胞生理状态，也可能与子代病毒粒子中非完整病毒粒子或非感染性病毒粒子的比例上升有关，具体机理仍然有待研究。

此外本试验中获得的重组细胞株既能够稳定表达TMPRSS2蛋白质，同时也具有与母本细胞一致的单细胞悬浮生长能力，在生物反应器中获得较高的细胞培养密度，为日后大规模悬浮培养禽流感疫苗提供了一株良好的备选宿主细胞。

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