转基因玉米MIR604结构特异片段实时荧光定量检测方法的建立

常丽娟， 宋 君， 雷绍荣， 尹 全， 王 东， 刘文娟， 张富丽

(四川省农业科学院分析测试中心，四川 成都 610066)

转基因玉米MIR604是瑞士先正达公司2005年研发的抗虫玉米，该品系采用根瘤农杆菌介导法转入来自苏云金芽孢杆菌的Cry3A基因，该基因编码的毒素蛋白由3个不连续的结构域组成，对鞘翅目昆虫具有特异毒性［1］。自2007年起，MIR604先后在美国、菲律宾、俄罗斯、韩国和日本等多个国家被批准作为食品和饲料的加工原料。中国于2008年批准进口MIR604作为食品和饲料的加工原料。按照中国转基因标识管理办法规定，MIR604及其加工产品必须进行标识。目前，中国转基因生物安全检测体系中只有MIR604及其加工产品的定性检测标准［2］，尚无相关的定量检测标准。欧盟曾经发布过基于TaqMan探针的实时荧光定量PCR检测标准［3］，但国内尚未对该标准进行验证。为了研制适合中国实验室的定量检测方法，本研究拟探索建立转基因玉米MIR604结构特异片断实时荧光定量PCR的检测方法，并对该方法的特异性、准确度及灵敏度进行分析，为中国转基因生物安全监管提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 含量为1%和10%的转基因玉米MIR604标准物质(Certified reference material，CRM)及其他转基因作物粉末材料均购自欧盟联合研究中心测量与标准物质研究所(IRRM，Institute for Reference Materials and Measurements，Joint Research Centre，Belgium);非转基因玉米、水稻、大豆、棉花、油菜、甜菜材料由本实验室保存。

1.1.2 试剂与仪器 植物基因组DNA纯化试剂和实时聚合酶链式反应试剂购自TIANGEN®天根生化科技(北京)有限公司。超微量分光光度计Nanodrop®1000，由Thermo Fisher Scientific Corporation生产。实时荧光PCR系统Real Time PCR System 7500，由美国Applied Biosystem Corporation生产。

1.2 试验方法

1.2.1 DNA的分离与纯化 按照植物基因组DNA纯化试剂盒［(TIANGEN®，天根生化科技(北京)有限公司)］说明书分离、纯化转基因玉米MIR604基因组DNA。

1.2.2 引物和探针设计 玉米内标基因zSSIIb采用国家标准 GB19495.4-2004 中的引物序列［4］;根据 MIR604的载体序列(http://www.shgmo.org/welcome.html)设计引物和探针构建MIR604特异性片断(表1)。

表1 转基因玉米MIR604定量检测的引物和探针Table 1 The primers and probes used for the quantitative detection of genetically modified maize MIR604

1.2.3 反应体系及条件 取4.0μl DNA加入到20.0μl反应体系［TaqMan Master mix(2×)10.0 μl，上下游引物(10 μmol/L)各 1.0 μl，探针(10 μmol/L)0.5 μl，补水至20.0 μl］，运行程序如下:95℃预变性10 min，1个循环;95℃变性15 s，59℃退火60 s，45个循环。

1.2.4 方法的特异性、准确度和灵敏度检测

1.2.4.1 特异性 对非转基因玉米、水稻、大豆、棉花、油菜、甜菜以及17个转基因玉米转化体、5个转基因水稻转化体、5个转基因大豆转化体、3个转基因棉花转化体、3个转基因油菜转化体和1个转基因甜菜转化体进行了特异性检测，确定方法的特异性。

1.2.4.2 准确度 分别提取1%和10%的转基因玉米MIR604基因组DNA，将10%MIR604基因组DNA按照 1∶5梯度稀释成42.00 ng、8.40 ng、1.68 ng、0.34 ng、0.07 ng，作标准曲线。以 1%MIR604基因组DNA为检测样品进行定量检测，检测样品重复24次扩增反应，计算1%MIR604标准物质的测量值。

1.2.4.3 灵敏度 将转基因玉米 MIR604的基因组DNA模板按照 1∶2梯度稀释成0.22 ng、0.11 ng、0.06 ng、0.03 ng、0.01 ng，每个梯度重复 8 次扩增反应。根据玉米基因组大小，计算出每个梯度反应体系中MIR604分子片段的拷贝数。

2 结果与分析

2.1 方法的特异性

采用本方法设计的引物和探针对6种非转基因作物、转基因玉米MIR604及其他非目标转基因作物进行检测，只有MIR604检测到扩增信号(图1)，其他非转基因作物和非目标转基因作物均未检测到扩增信号，显示本研究建立的检测方法具有很高的特异性。

图1 转基因玉米MIR604扩增的特异性Fig.1 The specificity of the method for detection of genetically modified maize MIR604

2.2 方法的准确度

为了验证方法的准确度，用10%转基因玉米MIR604的标准物质建立标准曲线，对1%MIR604进行定量检测，并连续重复24个平行样品。玉米内源基因zSSIIb的标准曲线方程为 Y=－3.40x+31.72，R2为 0.996，扩增效率为 96.76%(图 2A);MIR604分子片段的标准曲线方程为Y=－3.29x+33.08，R2为 0.997，扩增效率为 101.49%(图 2B)。说明设计的引物和探针扩增效率高，建立标准曲线方程的数据对之间的线性关系好。采用本研究建立的方法对1%MIR604标准物质进行定量检测，测试样品平均相对含量为1.05%，测量值与真实值的相对偏差为5%，方法具有较高的准确度。

2.3 方法的灵敏度

为了确认方法的灵敏度，分别以不同拷贝数的DNA为模板进行实时扩增，8次重复都有扩增信号的最低外源片段分子拷贝数为本方法的检测下限。试验结果表明本方法最低能检测到约为5个拷贝的MIR604核酸分子片段(表2)。

图2 特异性定量PCR方法扩增曲线Fig.2 The amplification curves for the construct-specific quantitative PCR method

表2 转基因玉米MIR604结构特异片段检测的灵敏度Table 2 The sensitivity of the method for detection of constructspecific fragment of genetically modified maize MIR604

3 讨论

荧光定量PCR技术是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。实时荧光定量PCR可分为SYBR Green I染料法和TaqMan探针法。转基因成分定量检测普遍采用TaqMan探针法。与SYBR Green I染料法相比［5］，TaqMan探针法由于要求引物和探针都要与DNA模板配对，在扩增反应过程中，通过外切核酸酶切断与探针连接的荧光蛋白而产生荧光信号，排除了引物二聚体和非特异性扩增DNA片段所产生的荧光信号对试验结果的干扰，在对数扩增期收集的荧光信号只来源于目的基因的扩增，所以TaqMan探针法具有更高特异性和更可靠的检测结果。

转基因玉米MIR604投放市场后，欧盟、日本和韩国等先后建立了其实时荧光定量PCR检测方法，欧盟还在此基础上建立起了MIR604荧光定量检测标准。日本和韩国［6-7］建立了MIR604品系特异荧光定量检测方法，通过对方法特异性、准确度、灵敏度的评估，确认了方法的可行性。目前，中国尚无MIR604的定量检测标准。本研究建立的方法标准曲线斜率在－3.6至－3.1之间，扩增效率在90%至110%的范围内，决定系数大于0.99，符合TaqMan探针法要求［8］;检测的最低含量为 5个拷贝的MIR604分子片段。表明，该方法具有特异性好、准确度高和灵敏度高的特点，可作为转基因玉米MIR604的定量检测方法。

［1］ 袁美妗，邓日强，胡晓晖，等.苏云金芽孢杆菌cry1Aa和cry3A结构域编码区的融合［J］.农业生物技术学报，2002，10(3):287-290.

［2］ 农业部1485号公告-16-2010.抗虫玉米MIR604及其衍生品种定性PCR方法［S］.

［3］ CRLVL04/05VP.Event-specific method for the quantification of maize line MIR604 using real-time PCR［S］.

［4］ GB19495.5-2004.转基因产品检测核酸定量PCR检测方法［S］.

［5］ ROTT M E，LAWRENCE T S，WALL E M.Development of realtime PCRsystems based on SYBRGreen Iamplifluore and Taqman technologies for specific quantitative detection of the transgenic maize event GA21［J］.Cereal Science，2004，39:99-107.

［6］ JUNICHI M，SATOSHI F，KAORI T，et al.Development and validation of event-specific quantitative PCR method for genetically modified maize MIR604［J］.Food Hyg Saf Sci，2012，53(4):166-171.

［7］ KIM J H，KIM H Y.Event-specific detection methods for genetically modified maize MIR604 using real-time PCR［J］.Food Science and Biotechnology，2009，18(5):1118-1123.

［8］ 张广远，孙红炜，李 凡，等.转基因玉米 MIR162转化事件特异性检测方法及其标准化［J］.作物学报，2013，39(7):1141-1147.