乙型肝炎病毒DNA在低温储存血浆中稳定性的研究

谢 丽，邓 燕，易 珍，陈学杰，黄 莉，李 山，秦 雪(广西医科大学第一附属医院检验科，南宁 530021)



乙型肝炎病毒DNA在低温储存血浆中稳定性的研究

谢 丽，邓 燕，易 珍，陈学杰，黄 莉，李 山△，秦 雪(广西医科大学第一附属医院检验科，南宁 530021)

目的 了解-20 ℃条件下储存30 d后血浆中乙型肝炎病毒(HBV)脱氧核糖核酸(DNA)的稳定性。方法 收集载量103～107copy/mL的30份乙型肝炎患者血浆，并分为低载量组、中载量组、高载量组。标本采集后立即分离血浆并进行基线(0 d)载量检测，其余血浆于-20 ℃存储，分别在第1、3、7、14、21和30天进行实时荧光定量测定。结果 (1)将30份样本进行不同时间点的配对t检验，载量差异均无统计学意义：第1天与第0天比较(t=-0.327，P=0.746)；第3天与第0天比较(t=-0.718，P=0.479)；第7天与第0天比较(t=-0.682，P=0.500)；第14天与第0天比较(t=-1.072，P=0.292)；第21天与第0天比较(t=-0.818，P=0.420)；第30天与第0天比较(t=0.635，P=0.530)。(2)分组比较中，第30天与第0天比较，HBV DNA载量差异无统计学意义：低载量组P=0.984；中载量组P=0.708；高载量组P=0.120。结论 -20 ℃储存30 d，血浆标本HBV DNA载量未出现连续下降或上升趋势，且不同时间点与第0天的基线载量比较差异无统计学意义。

储存时间； 乙型肝炎病毒； DNA； 稳定性

乙型肝炎病毒(HBV)感染是一个全球性的健康问题，是引起慢性肝炎、肝硬化、肝癌的主要原因之一。我国是HBV感染的高发地区，慢性乙型肝炎患者的高病毒载量与肝细胞性肝癌的发展密切相关[1]。目前，HBV感染的实验室诊断主要依赖血清特异性抗原抗体和DNA的检测，包括时间分辨荧光分析法、酶免疫测定技术、放射免疫分析法和实时荧光定量检测(RT-PCR)。前三种方法用于检测HBV血清标志物，是根据人体对HBV的免疫反应产生的表达产物及其抗体应答系统进行检测，间接反映复制情况。而RT-PCR是检测HBV的核酸，能更精确反映人体内HBV的数量状态，直接反映HBV复制传染性的指标。RT-PCR方法可用于诊断感染的慢性携带者、抗病毒治疗后的疗效评估、治疗药物的选择及协助诊断因遗传变异导致的血清学无法检测者[2-3]。本研究将30份血浆标本在-20 ℃条件下储存30 d，在第1、3、7、14、21和30天的6个时间点进行动态检测，分析稳定性，希望为相关实验室提供依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料 样本取自2013年1～8月广西医科大学第一附属医院感染性疾病科收治的乙型肝炎患者血浆30份，其中男22份，女8份；年龄16～45岁，平均28岁。其中，乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)、乙型肝炎病毒e抗体(抗-HBe)、乙型肝炎病毒核心抗体(抗-HBc)3项阳性即“小三阳”者18例，HBsAg、乙型肝炎病毒e抗原(HBeAg)、抗-HBc 3项阳性即“大三阳”者12例。

1.2 血浆样本 根据载量将30份无溶血的血浆样本分成3组：(1)10份样本为低载量(103～104copy/mL)，平均4 906 copy/mL，范围在1 754～8 153 copy/mL；(2)10份样本为中载量(104～105copy/mL)，平均52 647 copy/mL，范围14 780～88 912 copy/mL；(3)10份样本为高载量(105～107copy/mL)，平均1 002 528 copy/mL，范围85 670～2 511 660 copy/mL。

1.3 RT-PCR检测

1.3.1 样本处理 每例患者收集10 mL的全血至含乙二胺四乙酸(EDTA)的抗凝管(上海科华诊断医疗产品有限公司)，然后立即运送至实验室进行离心分离(700 r/min离心10 min)。取离心后无溶血的血浆标本1 mL立即进行基线RT-PCR分析(0 d)，其余血浆分成6管，每管1.5 mL在-20 ℃存储，分别在第1、3、7、14、21和30天取其中一份标本进行RT-PCR。每次检测前均进行再次离心(700 r/min离心10 min)。

1.3.2 RT-PCR 核酸提取和RT-PCR均使用乙型肝炎病毒(HBV)核酸定量测定试剂盒(湖南圣湘生物科技有限公司)。在PCR反应管中加入5 μL核酸释放剂(试剂盒提供)，再加入5 μL待测血浆样本，混匀后室温静置10 min，加入40 μL PCR反应试剂，混匀后上机进行PCR扩增。扩增和循环条件为：55 ℃反应2 min，94 ℃反应5 min，再按94 ℃ 15 s、57 ℃ 30 s进行45个循环。每次运行包含阴性对照、阳性对照和空白对照，阳性定量参考品(试剂盒提供)，同血清样本一起上机扩增，判断是否存在PCR抑制和防止假阳性结果。反应结束后，仪器根据标准曲线自动给出结果。实验室室温保持在22～24 ℃，相对湿度(65±5)% 。所有标本都是由相同的技术人员在同等条件下完成。

1.4 统计学处理 数据首先进行log10转换，应用配对t检验进行统计学分析，P<0.05表示差异有统计学意义，所有数据均经SPSS 17.0统计软件包处理。

2 结 果

2.1 不同时间点RT-PCR检测的载量 在30份血浆标本检测过程中，所有对照都成功地被检测，表明RT-PCR过程中无抑制和假阳性现象。各组标本在第0、1、3、7、14、21和30天RT-PCR检测的平均载量值如表1所示。

表1 不同时间点RT-PCR检测的HBV载量(log10 copy/mL)

HBV低载量组10份标本中，每毫升标本拷贝数的常用对数值3.192～3.911，在7个不同时间点检测的平均病毒载量相近，第0天与第30天平均病毒载量的常用对数值为3.638和3.639，且差异无统计学意义(t=0.021，P=0.948)。中载量组10份标本中，每毫升标本拷贝数的常用对数值4.170～4.949，在不同时间点检测的平均病毒载量相近，第0天与第30天平均病毒载量的常用对数值由4.658下降至4.648，且差异无统计学意义(t=-0.387，P=0.708)。高载量组10份标本中，每毫升标本拷贝数的常用对数值4.933～6.400，第0天与第30天平均病毒载量的常用对数值由5.747升高至5.780，且差异无统计学意义(t=1.717，P=0.120)。将30份样本进行不同时间点的配对t检验，载量差异无统计学意义，第1天与第0天比较(t=-0.327，P=0.746)；第3天与第0天比较(t=-0.718，P=0.479)；第7天与第0天比较(t=-0.682，P=0.500)；第14天与第0天比较(t=-1.072，P=0.292)；第21天与第0天比较(t=-0.818，P=0.420)；第30天与第0天比较(t=0.635，P=0.530)。

图1 第30天和第0天血浆样本稳定性比较

2.2 RT-PCR检测的第30天与第0天HBV载量值比较 所有30份标本RT-PCR检测的第30天与第0天HBV载量值见图1。其中，有4份标本第30天HBV载量值与第0天相近或重叠(7号、9号、24号和30号标本)；12份标本为第30天HBV载量值较第0天低(0.044±0.030)，差异有统计学意义(t=5.085，P=0.000)；14份标本为第30天HBV载量值比第0天稍高(-0.052±0.049)，差异有统计学意义(t=-4.031，P=0.001)。全部样本第30天与第0天比较，HBV载量差异无统计学意义(t=0.635，P=0.530)。

3 讨 论

到目前为止，RT-PCR是一种快速、敏感、实用的检测方法。但是，在我国仍有许多医院并未具备开展检测病毒载量的临床基因扩增实验室。因此，部分乙型肝炎患者标本只能定时定点地送往远离的病毒学实验室。可见，当务之急是如何保证血液标本收集、处理和存储方法正确、恰当并优化，以确保后续HBV载量检测结果的准确性和重复性。

PCR技术中核酸提取是一个重要环节，本试验中采用一步法提取，无需对样本进行加热、高速离心富集病毒等过程，能够避免病毒核酸的损失，也避免了可能的核酸酶污染，从而使定量更准确。Schafer等[4]认为，延迟血浆样本的处理可能导致巨细胞病毒PCR结果的假阳性率增高。自从HBV检测试剂盒商品化后，分析前质量控制的重要性就不言而喻，如样本收集、运输、处理等，延迟处理就可能导致细胞破坏、标本溶血，影响PCR检测的准确性[4]。为排除血浆中不可预测的影响因素，本研究在每次测试前都对样本进行重复离心，从而有助于确保PCR检测的准确性，对于第30天载量测定与第0天之间差异无统计学意义起一定的积极作用。

对于血清样本的稳定性，不仅储存温度、储存时间对其有影响，反复冻融也可能是影响因素之一。Sanlidag等[5]对5份血清样本在首次采集后于-20 ℃冻存2 d，在随后的10次反复溶解、冻存中检测稳定性，结果未见改变。表明对于临床标本无需采集后进行小份分装，不但减少工作强度，且在反复冻存、溶解10次内进行检测，其结果仍然有效。但是，该试验标本较少，其可靠性仍需进一步证实。而本试验中，每份标本的检测均为一次性冻存和溶解过程，排除了多次反复冻存溶解对结果的可能影响。结果显示，不管是分为HBV低病毒载量组、中病毒载量组和高病毒载量组，或不分组分析，30份样本的HBV平均载量值在第0天与其他6个时间点(第1、3、7、14、21、30天)比较，差异无统计学意义，试验中血浆样本储存于-20 ℃，结果与已发表的研究相似。Jose等[6]报道，血浆样本在5、25 ℃储存28 d，其稳定性不变。Gessoni等[7]研究报道，血浆样本丙型肝炎病毒(HCV)、人类免疫缺陷病毒(HIV-1) 和HBV的稳定性，在4 ℃条件下，HCV和HIV-1的核糖核酸能够储存72 h，HBV DNA能够储存7 d。

对于定量PCR检测的室间质量评价的可接受范围，我国卫生部临床检验中心采用溯源至国家标准品得出的检测值换算成的对数值±0.4为可接受范围[8]。试验的30份标本，可能由于个体差异和技术固有误差而导致第30天结果低于或高于第0天，分别比较后差异有统计学意义，但各对数值均在可接受范围内。当不分组比较后，全部样本第30天与第0天比较HBV载量差异无统计学意义(t=0.635，P=0.530)，说明升高或降低对临床判断影响极小。同样，Baleriola等[9]报道，临床样品在-20、-70 ℃存储长达9年后，检测HCV、HIV、HBV载量，认为其改变对于临床判断无影响。并且，Fung等[10]报道，冷冻保存105份临床样品12个月后，其HBsAg表达也无改变，仍可用于临床监测。

综上所述，本研究结果表明，血浆标本-20 ℃储存30 d中，在第1、3、7、14、21和30天的6个时间点进行动态检测，HBV载量未出现连续下降或上升的改变，且不同时间点与第0天的基线载量比较差异均无统计学意义。希望能为相关临床实验室提供有用的试验依据：如果未能每天进行PCR检测，可在一定时间内(30 d)每周进行几次HBV载量的批处理测试；对于一些临床需要复检的结果，在排除不可预测的血浆因素后(如重复离心)，30 d内进行重复检测，其结果可信；实验室都应根据各自的技术条件对临床标本的储存条件进行优化，以保障PCR检测的规范性和结果的准确性。

[1]Zhou JY,Zhang L,Li L,et al.High hepatitis B virus load is associated with hepatocellular carcinomas development in Chinese chronic hepatitis B patients:a case control study[J].Virology Journal,2012,92(9):16-20.

[2]Park NH,Chung YH.Molecular mechanisms of hepatitis B virus-associated hepatocellular carcinoma[J].Korean J Hepatol,2007,13(3):320-340.

[3]李金明.聚合酶链反应临床应用的优越性和局限性[J].中华检验医学杂志,2005,28(3):225-226．

[4]Schafer P,Tenschert W,Schroter M,et al.False-positive results of plasma PCR for cytomegalovirus DNA due to delayed sample preparation[J].J Clin Microbiol,2000,38(9):3249-3253.

[5]Sanlidag T,Akcali S,Ozbakkaloglu B.Serum hepatitis B DNA:stability in relation to multiple freeze-thaw procedures[J].J Virol Methods,2005,123(1):49-52.

[6] Jose M,Gajardo R,Jorquera J.Stability of HCV,HIV-1 and HBV nucleic acids in plasma samples under long-term storage[J].Biologicals,2005,33(1):9-16.

[7] Gessoni G,Barin P,Valverde S,et al.Biological qualification of blood units:considerations about the effects of sample′s handling and storage on stability of nucleic acids[J].Transfus Apheresis Sci,2004,30(3):197-203.

[8] 肖艳群,蒋玲丽,金中淦,等.定量PCR HBV DNA室间质量评价可接受范围的探讨[J].检验医学,2012,27(6):503-505.

[9] Baleriola C,Johal H,Jacka B,et al.Stability of hepatitis C virus,HIV,and hepatitis B virus nucleic acids in plasma samples after long-term storage at -20 ℃ and -70 ℃[J].J Clin Microbiol,2011,49(9):3163-3167.

[10] Fung J,Lai CL,Young J,et al.Stability of hepatitis B surface antigen over time:implications for studies using stored sera [J].J Med Virol,2011,83(11):1900-1904.

Stability of hepatitis B virus DNA in plasma in low temperature storage

XIELi,DENGYan,YIZhen,CHENXue-jie,HUANGLi,LIShan△,QINXue

(DepartmentofClinicalLaboratory,FirstAffiliatedHospitalofGuangxiMedicalUniversity,Nanning,GuangxiZhuangAutonomousRegion530021,China)

Objective To analyze stability of HBV DNA in 30 EDTA anticoagulants plasma in the order of magnitude between 1 000 and 10 000 000 copy/mL over a 30 day period.Methods Thirty plasma samples were grouped into three categories according to the viral loads,including low viral loads,intermediate viral loads and high viral loads.Ten milliliters of whole blood was freshly collected from each patient.Plasma samples without hemolysis were divided into 1 mL aliquots.One aliquot was processed immediately(Day 0) for baseline RT-PCR assays.The remaining aliquots were then processed after 1,3,7,14,21 or 30 day of storage at -20 ℃.Results There was no significant difference between the mean of the difference time point in viral loads following storage at -20 ℃ by paired-samples t test,including Day 1 compared to Day 0 (t=-0.327，P=0.746),Day 3 compared to Day 0(t=-0.718，P=0.479),Day 7 compared to Day 0(t=-0.682，P=0.500),Day 14 compared to Day 0 (t=-1.072，P=0.292),and Day 21 compared to Day 0 (t=-0.818，P=0.420).Day 30 compared to Day 0(t=0.635，P=0.530).Conclusion The concentration of HBV DNA in all samples stored at -20 ℃ for 30 days did not differ significantly from the baseline viral load,and it was not observed the trend in continued degradation in different time point( Day 1,3,7,14 and 21).

prolong period; cytomegalovirus; DNA; stability

谢丽，女，主管技师，在读博士，主要从事基因组学方面的研究。

△通讯作者，E-mail：lis8858@163.com。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.08.023

A

1672-9455(2015)08-1086-03

2014-12-05

2014-12-20)