慢性丙型肝炎患者HCV基因分型与HCV-RNA浓度和凝血功能关系的探讨*

姜树朋，李 艳，汪 明，乔 斌(武汉大学人民医院检验科，武汉 430060)



·论 著·

慢性丙型肝炎患者HCV基因分型与HCV-RNA浓度和凝血功能关系的探讨*

姜树朋，李 艳△，汪 明，乔 斌(武汉大学人民医院检验科，武汉 430060)

目的 探讨慢性丙型肝炎病毒(HCV)患者基因分型与HCV-RNA浓度和凝血功能之间的关系。方法 选取该院HCV患者66例作为慢性HCV患者组，健康人群20例作为健康对照组。对该院66例HCV患者采用ABI3500dx基因测序仪进行外周血HCV-RNA基因分型检测以及采用罗氏Light Cycler荧光定量PCR仪进行外周血HCV-RNA定量检测，对该院66例HCV患者和20例健康体检者进行凝血酶原时间(PT)、活化部分凝血活酶时间(APTT)、凝血酶时间(TT)、血浆纤维蛋白原(FIB)检测。结果 在66例HCV患者中，分别检测出1a、1b、2a、3a、3b 和6a 型6种病毒基因型，其中基因1型39例，非基因1型27例。不同HCV基因型患者血清HCV病毒浓度比较差异有统计学意义(P<0.05)。HCV基因1型和非基因1型之间比较，凝血功能差异均无统计学意义(P>0.05)；HCV基因1型和非基因1型分别与健康对照组比较，凝血功能差异均有统计学意义(P<0.05)。HCV-RNA浓度与PT、APTT、TT、FIB的相关性差异均无统计学意义，相关系数分别为0.020、0.002、-0.072、-0.088(P>0.05)；HCV-RNA低浓度组(<5.0×105U/mL)和高浓度组(≥5.0×105U/mL)之间凝血功能比较差异无统计学意义(P>0.05)；HCV-RNA低浓度组和高浓度组分别与健康对照组比较，差异有统计学意义(P<0.05)。结论 不同基因型HCV感染与血液中HCV的病毒浓度相关，基因1型患者HCV-RNA浓度高于非1型患者；HCV基因分型和RNA病毒浓度与凝血功能各项指标大小无关，但是HCV患者较健康人群凝血功能降低，对于HCV感染者有必要进行凝血功能检查，以便了解HCV患者凝血功能状态，防止出现严重的出血。

慢性丙型肝炎； HCV基因分型； HCV-RNA浓度； 凝血功能

肝脏不仅是人体代谢的重要器官，同时也是合成多种凝血因子的重要场所，当肝脏受损(如肝炎、肝脏纤维化、肝癌等)时，凝血因子合成减少，造成凝血时间延长，容易发生内脏出血，是导致患者死亡的重要原因之一。丙型肝炎病毒(HCV)感染是导致慢性肝病、肝脏纤维化、肝癌的常见原因。HCV由于其基因的高度变异，根据病毒株核苷酸序列的同源性差异，可将其分为不同的基因型。目前已知HCV至少可分为6型(HCV 1～6型)，各型又分为许多亚型(如1a、1b、2a、2b、3a等)。不同基因型的HCV对治疗药物(如聚乙二醇干扰素、利巴韦林)的敏感程度不同，确定HCV感染者基因型有助于临床治疗和合理用药[1-2]。但是，关于HCV基因分型及病毒浓度与肝损伤之间关系不同的研究尚未得出统一的结论。本研究分析66例慢性丙肝患者HCV基因分型与HCV-RNA浓度、基因分型和凝血功能的关系，以及HCV-RNA浓度和凝血功能的相关性，进一步探讨HCV基因分型、病毒浓度和肝组织损伤之间的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料 慢性HCV患者组：选取2013年8月至2014年8月于本院住院诊治的慢性HCV患者66例，男36例，女30例;年龄20～70岁，平均35岁，诊断符合2010年版《丙型肝炎防治指南》的标准。健康对照组：选取本院同时期健康体检人群20例作为对照组,男10例，女10例;年龄20～70岁，平均39岁。

1.2 方法

1.2.1 HCV-RNA基因分型检测 对慢性HCV患者HCV-RNA提取采用EDTA抗凝血浆TRIzol LS试剂提取法，提取后的RNA使用Thermo公司的RevertAidTM第一链cDNA Synthesis试剂盒进行逆转录，逆转录引物为随机引物；测序引物Forward primer 5′-TTA ACC ACA TCM RCT CCG TGT G-3′,Reverse primer 5′-GTA CCT GGT CAT AGC YTC CGT RAA-3′，使用ABI3500dx基因测序仪测序，并将所测序列与HCV-RNA参考序列AF009606、AF271632和AF139594等(NCBI GenBank)进行比对分析，得出检测结果。

1.2.2 HCV-RNA浓度的测定 采用凯杰生物工程(深圳)有限公司提供的HCV核酸定量检测试剂盒(定量检测线性范围：1.0×103～5.0×107U/mL)，在提取HCV-DNA后，使用罗氏Light Cycler荧光定量PCR仪进行检测。当被测样本中HCV-RNA浓度1.0×103～5.0×107U/mL，则测定结果有效，可直接报告相应的RNA浓度；当被测样本中HCV-RNA>5.0×107U/mL时，结果报告为大于5.0×107U/mL，本研究HCV-RNA>5.0×107U/mL时，按5.0×107U/mL记录；当被测样本中HCV-RNA<1.0×103U/mL时，结果报告为小于1.0×103U/mL，本研究HCV-RNA<1.0×103U/mL时，按1.0×103U/mL记录；当被测样本结果无循环阈值，即Ct值时，结果报告为0.0 U/mL。

1.2.3 凝血功能检测 采集慢性丙型肝炎患者及健康对照组枸橼酸钠抗凝血后，立即轻轻颠倒混匀，离心后，使用日本SYSMEX公司全自动凝血分析仪CA-7000及配套试剂进行凝血功能测定，即凝血酶原时间(PT)、活化部分凝血活酶时间(APTT)、凝血酶时间(TT)、血浆纤维蛋白原(FIB)4项。

2 结 果

2.1 HCV基因分型与HCV-RNA浓度 在66例慢性HCV患者中，分别检测出1a、1b、2a、3a、3b 和6a 型6种病毒基因型，其中基因1型39例，非基因1型27例。不同HCV基因型患者血清病毒浓度(lg U/mL)比较：基因1型患者HCV-RNA浓度为6.83±0.84，非1型患者HCV-RNA浓度为6.24±1.33，P<0.05，两者差异具有统计学意义，不同基因型HCV感染与血液中HCV的病毒浓度相关，基因1型患者HCV-RNA浓度高于非1型患者。

2.2 HCV基因分型与凝血功能 见表1。HCV基因1型与非基因1型之间比较，即不同HCV基因型之间凝血功能的差异无统计学意义(P>0.05)。在20例健康对照组中，凝血功能检测结果：PT为(10.72±0.50)s，APTT为(24.30±2.13)s，TT为(18.0±1.09)s，FIB为(3.03±0.51)g/L。HCV基因1型和非基因1型两组分别与健康对照组比较，差异均有统计学意义(P<0.05)。

表1 HCV基因1型与非基因1型凝血功能比较±s)

2.3 HCV-RNA浓度与凝血功能 HCV-RNA浓度与PT、APTT、TT、FIB的相关性差异均无统计学意义，相关系数分别为0.020、0.002、-0.072、-0.088(P>0.05)。见表2。HCV-RNA高、低浓度组比较，即不同HCV-RNA浓度组之间凝血功能的差异无统计学意义(P>0.05)。HCV-RNA低浓度组(<5.0×105U/mL)和高浓度组(≥5.0×105U/mL)与健康对照组比较差异均有统计学意义(P<0.05)。

表2 不同HCV-RNA浓度组之间凝血功能的差异±s)

3 讨 论

由于HCV病毒基因的高度变异，不同基因分型HCV病毒表现出了不同的生物学特性，包括病毒的复制能力和致病能力，在本研究66例慢性HCV患者中，基因1型39例，非基因1型27例，基因1型和非1型患者血清中HCV-RNA浓度差异有统计学意义，不同基因分型HCV感染与血液中HCV的病毒浓度相关，基因1型患者HCV-RNA浓度高于非1型患者。本研究结果与其他学者的研究结果一致[3-6]。

PT主要反映外源性凝血系统状况，PT延长主要见于凝血因子Ⅱ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅹ减少，FIB缺乏，维生素K缺乏，DIC等；APTT主要反映内源性凝血系统状况，见于凝血因子Ⅱ、Ⅴ、Ⅷ、Ⅸ、Ⅺ、Ⅻ减低，纤维蛋白原缺乏，抗凝物质存在等；TT主要反映纤维蛋白原(即凝血因子Ⅰ)转为纤维蛋白的时间，TT延长见于低纤维蛋白原血症、异常纤维蛋白原血症。FIB主要反映纤维蛋白原的浓度，FIB减少见于肝损伤，低纤维蛋白原血症，异常纤维蛋白原血症等。

HCV基因分型不但与聚乙二醇干扰素的抗病毒疗效相关，而且与肝脏组织的病理损伤相关，如1b型多见于失代偿期肝硬化和原发性肝癌的患者，1a、2a、2b、3a型则多见于慢性HCV不合并肝硬化和肝癌患者，基因3a型与肝脏脂肪病变的关系比较密切[11]。刘志英等[12]对92例北京地区肝硬化和慢性HCV患者进行的基因型分布比较结果表明，尚未发现HCV基因型因肝病严重程度而有所不同。本研究显示，基因1型和非1型患者之间的凝血功能4项指标的差异无统计学意义，但HCV基因型是否与肝脏的组织损伤相关需要进行肝组织病理学检查进一步明确。

虽然HCV特异性的细胞免疫可造成肝细胞的损伤，但更主要的是干扰细胞的代谢，同时，病毒蛋白直接刺激成纤维细胞产生纤维组织，从而造成在多数慢性HCV肝炎患者的PT、APTT、TT和FIB常在相对低水平波动[13-16]。说明凝血功能指标变化虽可反映肝细胞损害程度，但该指标与HCV感染引起的肝组织炎性反应程度和病情的严重程度不一定平行。其他学者的研究也显示，HCV感染者中肝组织的损伤和HCV-RNA的病毒浓度无关，不能以病毒浓度来判断肝组织的炎性反应活动程度[17-19]。

综上所述，慢性HCV患者不同基因分型HCV感染与HCV的病毒浓度相关，基因1型患者HCV-RNA浓度高于非1型患者。HCV基因分型和RNA病毒浓度与凝血功能各项指标大小无关，但是慢性HCV患者较健康人群，凝血功能降低。因此，对于HCV感染者有必要进行凝血功能检查，以便了解慢性HCV患者凝血功能状态，防止出现严重的出血。

[1]Pol S,Corouge M.Treatment of hepatitis C:current status and perspectives[J].Rev Prat,2014,64(5):605-612.

[2]Alexopoulou A,Papatheodoridis GV.Current progress in the treatment of chronic hepatitis C[J].World J Gastroenterol,2012,18(42):6060-6069.

[3]严艳,李卓,郭向华,等．北京地区慢性丙型肝炎患者血清HCV-RNA定量检测与基因分型的研究[J]．医学理论与实践,2007,20(7):756-757．

[4]Yoo TW,Donfield S,Lail A,et al.Effect of hepatitis C virus(HCV) genotype on HCV and HIV-1 disease[J].J Infect Dis,2005,191(1):4-10.

[5]Marrone A,Sallie R.Genetic heterogeneity of hepatitis C virus:the clinical significance of genotypes and quasispecies behavior[J].Clin Lab Med,1996,16(2):429-449.

[6]Bukh J,Miller RH,Purcell RH.Genetic heterogeneity of hepatitis C virus:quasispecies and genotypes[J].Semin Liver Dis,1995,15(1):41-63.

[7]Rehermann B.Hepatitis C virus versus innate and adaptive immune responses:a tale of coevolution and coexistence[J].J Clin Invest,2009,119(7):1745-1754.

[8] Zeisel MB,Fafi-Kremer S,Robinet E,et al.Adaptive immunity to the hepatitis C virus[J].Viruses,2009,1(2):276-297.

[9]Heim MH.Innate immunity and HCV[J].J Hepatol,2013,58(3):564-574.

[10]高得勇,张欣欣.丙型肝炎免疫发病机制的研究进展[J].国际流行病学传染病学杂志,2006,33(1):61-64.

[11]解莹,谢晨.丙型肝炎病毒基因分型的研究进展[J].大连医科大学学报,2010,32(4):470-474．

[12]刘志英,魏红山,戴旺苏,等.北京地区丙型肝炎患者的丙型肝炎病毒基因分型[J].中华流行病学杂志,2005,2(26):148-149．

[13]Felmlee DJ,Hafirassou ML,Lefevre M,et al.Hepatitis C virus,cholesterol and lipoproteins--impact for the viral life cycle and pathogenesis of liver disease[J].Viruses,2013,5(5):1292-1324.

[14]Koike K,Tsutsumi T,Yotsuyanagi H,et al.Lipid metabolism and liver disease in hepatitis C viral infection[J].Oncology,2010,78(1):24-30.

[15]Koike K.Steatosis,liver injury,and hepatocarcinogenesis in hepatitis C viral infection[J].J Gastroenterol,2009,44(19):82-88.

[16]Domitrovich AM,Felmlee DJ,Siddiqui A.Hepatitis C virus nonstructural proteins inhibit apolipoprotein B100 secretion[J].J Biol Chem,2005,280(48):39802-39808.

[17]李蕴铷,凌伟,陈凤新,等.慢性丙型肝炎患者脂类代谢与丙型肝炎病毒复制以及肝脏病理的关系[J].世界华人消化杂志,2010,18(17):1820-1823.

[18]王敏乐,晓华,韩红星,等.HCV-RNA病毒载量和肝脏病理的关系[J].实用医学杂志,2006,22(13):1513-1514.

[19]Rodríguez-Iigo E,López-Alcorocho JM,Bartolomé J.Percentage of hepatitis C virus-infected hepatocytes is a better predictor of response than serum viremia levels[J].J Mol Diagn,2005,7(4):535-543.

Relationship between HCV genotypes with content of HCV-RNA and coagulation function in chronic hepatitis C patients*

JIANGShu-peng,LIYan△,WANGMing,QIAOBin

(DepartmentofClinicalLaboratory,RenminHospitalofWuhanUniversity,Hubei430060,China)

Objective To investigate the relationship between HCV genotypes with content of HCV-RNA and coagulation function in chronic hepatitis C patients.Methods 66 patients with chronic hepatitis C and 20 healthy control subjects in our hospital were enrolled in this study.The HCV genotypes were determined by ABI3500dx gene sequencing machine and the level of serum HCV-RNA was measured with Roche Light Cycler real-time fluorescent quantitative reverse transcription polymerase chain reaction system.The level of PT,APTT,TT,FIB detection in all cases was examined.Results In 66 cases of chronic hepatitis c patients,six virus genotypes were detected which were,1a,1b,2a,3a,3b and 6a,respectively.The genotype 1 was 39 cases,and the other of non-genotype 1 was 27 cases.The comparative difference level of serum HCV in patients with different HCV genotypes was statistically significant (P<0.05).As to the coagulation function,no significant difference of the genotype 1 and the non-genotype 1 was found(P>0.05)，and the difference between the healthy control and HCV genotype group(the genotype 1 and the non-genotype 1) in the coagulation function was statistically significant(P<0.05).The level of PT,APTT,TT,FIB were not related with HCV-RNA content with coefficient correlation 0.020,0.002,-0.072,-0.088,respectively(P>0.05).The different of coagulation function between the low HCV-RNA content group(<5.0×105U/mL) and high content group(≥5.0×105U/mL) had no statistical significance(P>0.05)，and the difference of coagulation function between HCV-RNA content group(The low HCV-RNA content group and high content group) and healthy control group was statistically significant(P<0.05).Conclusion The HCV genotype is associated with HCV-RNA content in the serum,and HCV-RNA content with HCV genotype 1 patients is higher than those with non-genotype 1 patients.The relationship between HCV genotypes,the content of HCV-RNA and coagulation function in chronic hepatitis C patients is not apparent,but compared with healthy people,coagulation function of the patients with chronic hepatitis C decreases.The test of coagulation function is necessary for HCV infection in order to know the state of blood coagulation function in patients with chronic hepatitis C,and prevent severe bleeding.

chronic hepatitis C; HCV genotypes； HCV-RNA content; coagulation function

国家重点临床专科建设项目[财社(2010)305号]。

姜树朋，男，在读硕士研究生，主要从事个体化医疗与分子诊断方面的研究。△

，E-mail：yanlitf1120@163.com。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.08.001

A

1672-9455(2015)08-1027-03

2014-11-15

2014-12-22)