感染鸭乙型肝炎病毒鸭外周血CD4+和CD8+T淋巴细胞水平变化*

聂云天，刘伯阳，王 琪

全球乙型肝炎病毒感染者有3.5亿人，是严重危害人类健康的疾病。乙型肝炎病毒本身并不直接引起肝细胞病变。病毒感染者体内细胞复制，将病毒抗原释放到肝细胞膜上，激发机体的免疫反应，从而产生一系列临床症状。因此，免疫损伤是乙型肝炎病毒致病的主要机制。本研究建立鸭乙型肝炎病毒感染模型，分析了鸭外周血CD4+T细胞和CD8+T细胞数的变化，现将结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物、设备与试剂 30只SPF级实验白鸭（本校动物实验中心提供），平均体质量（2.0±0.3）kg，4～6月龄。鸭乙型肝炎I型病毒血清、抗鸭淋巴细胞亚群单克隆抗体、检测乙型肝炎病毒血清指标试剂盒和检测DHBsAg试剂盒（广东健客医药有限公司）。流式细胞仪（FACS CantoⅡ，美国BD公司）；AMS-300型自动生化分析仪（北京奥普森公司）。

1.2 鸭肝炎模型制备 取15只实验鸭，经颈静脉注射鸭乙型肝炎I型病毒血清100 mg/只/次，连续7日后，取实验鸭外周血1 m l，采用ELISA法检测血清鸭HBsAg、鸭HBeAg和抗-鸭HBc[1]。

1.3 外周血生化和CD4+T和CD8+T细胞数检测 在实验鸭和健康鸭，分别经颈静脉取血2 m l。依次用自动生化分析仪检测血肝功能指标；每只动物取血400μl，抗凝处理，将血分装4个试管，向各管分别加入抗CD4-藻红蛋白（PE）40 μl，再依次加入抗CD8-PE40μl、避光室温充分结合30 min后，每管加入溶血素3 m l，避光放置至透明后，3000 r/m离心5 min，弃去上清液，加入磷酸盐缓冲液（PBS）4 ml，在混合器上使试管底部的细胞与PBS溶液混匀，再3000 r/m离心5 min，最后加入PBS 0.5 mL溶液，混匀，直接上流式细胞仪检测。

1.4 统计学处理 应用SPSS 18.0统计软件，计量资料以（）表示，两组间比较采用双侧组间或配对t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 模型制备情况 在注射病毒血清7日后，15只实验鸭血清HBsAg、鸭HBeAg和抗-鸭HBc均阳性，说明感染成功。感染组动物肝功能损害明显，血清ALT、AST水平急剧升高，与健康对照组比，差异显著（P<0.01，表1）。

2.2 外周血CD4+T和CD8+T细胞数比较 见表2。

3 讨论

HBV和DHBV均为嗜肝DNA病毒，它们都有相似的基因组和病毒结构特征，均具有通过RNA逆转录复制的特性。DHBV感染鸭模型是研究HBV基因突变、细胞表面病毒受体、病毒清除机制以及筛选新的抗病毒药物的合适动物模型[2]。DHBV感染成年鸭后血清ALT、AST、总胆红素和凝血酶原时间明显升高，同时外周血CD4+T和CD8+T淋巴细胞数有所变化，说明病毒致病成功[3]。相关研究表明，乙型肝炎的发生是机体与病毒相互作用的结果。HBV侵入肝细胞内增殖，可使受染细胞表达 HBsAg和 HBeAg等，后者可被机体免疫系统所识别，引起一系列免疫应答[4]。外周血T淋巴细胞是宿主抗病毒、抗肿瘤免疫反应中起主导作用的免疫活性细胞，构成了免疫系统的主要部分[5～6]。

表1 两组动物肝功能指标（）比较

表1 两组动物肝功能指标（）比较

①P＜0.01；②P＜0.05

例数 ALT（U/L） AST（U/L） TBIL（μmol/L） TP（g/L） PT（s）感染组 15 332.5±126.5① 177.8±244.7① 3.3±0.1② 26.1±19.9 12.9±4.0②对照组 15 23.2±28.7 20.9±7.7 1.9±0.1 26.7±12.0 7.9±1.2

表2 两组外周血CD4+T和CD8+T细胞数（%，）比较

表2 两组外周血CD4+T和CD8+T细胞数（%，）比较

与对照组比，①P<0.001；②P<0.05

例数 CD4+T细胞 CD8+T细胞 CD4+T/CD8T比值感染组 15 38.41±9.59① 23.80±6.44① 1.64±0.07②对照组 15 23.06±12.30 17.65±10.83 1.36±0.12

T淋巴细胞由不同亚群组成，成熟T细胞以CD3+为代表，按表型不同可将其分为CD4+T细胞和 CD8+T细胞等亚型，其中这两者占有很大的比例。CD4+T细胞为辅助性T细胞（Th），CD4+细胞数量与免疫功能呈正相关[7，8]。CD8+细胞为细胞毒性T细胞（CTL），在CD4+淋巴细胞存在的辅助下对清除感染的肝细胞及清除病毒有重要作用，而且CD4+淋巴细胞Th1亚型通过直接对肝细胞的溶解而间接清除病毒，同时也使肝脏病变加重[9，10]。在急性HBV感染时，CD4+细胞数显著增高，CD4+除在免疫应答中起辅助和诱导作用外，还分泌细胞因子，发挥部分细胞毒作用，并启动迟发性过敏反应[11]。CD4细胞减少和功能下降会导致机体免疫功能低下，尤其是细胞免疫功能低下，使得 HBV不能被有效清除[12]。

根据实验结果可知，实验感染动物CD4+T和CD8+T细胞数均明显高于正常对照组，表明当HBV侵入机体时，HBV就会激发细胞免疫机制[13]，大量的CD4+T和CD8+T细胞就会释放入血，进入被感染组织或细胞，可以快速识别病原体，并特异性杀伤靶细胞，有效遏制HBV的复制，其中有细胞毒作用的CD8+细胞发挥的杀伤靶细胞，清除病原体作用更为明显[14]。实验结果显示CD4/CD8比值明显升高，符合HBV感染机体的初期特征[15]，CD4/CD8细胞比值是监测机体细胞免疫功能，反映机体免疫状态的重要指标[16]。

综上所述，要想有效遏制HBV的复制和减轻肝损伤，提高细胞免疫能力是关键，其中维持淋巴细胞稳定可以使细胞免疫更好的发挥作用。及时对乙型肝炎病毒感染者外周血T淋巴细胞亚群进行检测，可以了解其免疫功能状态，为临床观察提供实验指标。

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