痛风消停汤对AGA大鼠踝关节炎性因子表达的影响

周天寒，黄学宽，张超男，邓福忠，王志红，杨治国，王　玲，杨　玉（.重庆医药高等专科学校，重庆　4033；.重庆医科大学中医药学院，重庆　4033）

痛风消停汤对AGA大鼠踝关节炎性因子表达的影响

周天寒1，黄学宽2，张超男2，邓福忠1，王志红1，杨治国1，王玲2，杨玉2
（1.重庆医药高等专科学校，重庆401331；2.重庆医科大学中医药学院，重庆401331）

［摘要］目的：研究痛风消停汤对急性痛风性关节炎（AGA）大鼠受试踝关节滑膜组织炎性因子的影响。方法：60只SD雄性大鼠随机分为正常组、模型组、秋水仙碱组，痛风消停汤低、中、高剂量组，每组10只。正常组常规喂养，其余各组采用尿酸钠（MSU）溶液注射法建立急性痛风性关节炎模型。造模前2日，正常组与模型组按20mL/kg予以生理盐水灌胃，秋水仙碱组0.3mg/kg灌胃，1日1次；痛风消停汤低、中、高剂量组分别按2g/kg、4g/kg、8g/kg体质量给予痛风消停汤灌胃，1日1次，直至造模后第7日，连续9日。实验结束后，检测血尿酸，采用ELISA法检测受试踝关节IL-1β、IL-6、TNF-α的含量，免疫组化法检测TGF-β及其受体（TGF-βR1）的表达。结果：与正常组比较，模型组大鼠血尿酸、受试踝关节滑膜组织中IL-1β、IL-6、TNF-α含量明显升高（P＜0.05）；与模型组比较，痛风消停汤各组大鼠血尿酸、受试踝关节滑膜组织中IL-1β、IL-6、TNF-α含量明显降低（P＜0.05），而痛风消停汤各组TGF-β1及TGF-βR1的表达较其他各组明显增强（P＜0.05）。结论：痛风消停汤治疗急性痛风性关节炎的机制可能与上调TGF-β1及TGF-βR1的表达、抑制IL-1β、IL-6、TNF-α的表达有关。

［关键词］痛风消停汤；大鼠；急性痛风性关节炎；炎性因子

［Abstract］Objective：To investigate the effect of Tongfeng Xiaoting Decoction on the inflammatory factors in ankle joint synovial tissue of acute gouty arthritis rats(AGA).Method：60 male SD rats were randomly divided into 6 groups：normal group, model group, colchicine group and low, medium and high Tongfeng Xiaoting Decoction groups (10 in each group).AGA model was established by induced monosodium urate (MSU) method except the normal group. Two days before AGA model was established, rats in normal and model groups received intra-gastric normal saline(NS) by 20ml/kg.d for qd, colchicine group received colchicine by 0.3mg/kg.d for qd, while those in low, medium and high Tongfeng Xiaoting Decoction groups received Tongfeng Xiaoting Decoction at the liquid of 2g /kg,4g /kg and 8g/kg respectively, once daily, until 7 days after model was formed, continuously for 9 days. After the experiment, serum uric acid was detected, the expression of IL-1β、IL-6、TNF-α、TGF-β1 were detected by ELISA and the expression of TGF-β1 and TGF-βR1 were detected by immunohistochemistry. Result：Serum uric acid and the content of IL-1β、IL-6、TNF-α、TGF-β1 in ankle joint synovial membrane were increased significantly in the model group compared to that of the normal group（P＜0.05）.Serum uric acid and the content of IL-1β、IL-6、TNF-α、TGF-β1 in ankle joint synovial membrane were decreased significantly in Tongfeng Xiaoting Decoction groups compared to that of the model group（P＜0.05）. The expression of TGF-β1and TGF-βR1 in ankle joint synovial membrane were increased significantly in Tongfeng Xiaoting Decoction groups compared to that of the others group（P＜0.05）.Conclusion: The mechanism of treating gouty arthritis by Tongfeng Xiaoting Decoction may be through up-regulating the expression of TGF-β1 ,TGF-rβ1 and inhibiting the expression of IL-1β、IL-6、TNF-αin synovial tissue.

［Key Words］Tongfeng Xiaoting Decoction; acute gouty arthritis; inflammatory Factors

痛风（Gout）是长期嘌呤代谢障碍、血尿酸增高导致组织损伤的疾病，而急性痛风性关节炎（acyte gouty arthritis，AGA）则是痛风的特征性临床表现。尿酸钠晶体析出、沉淀于关节腔内，导致大量炎性细胞浸润，促使关节出现剧烈疼痛、红肿和功能障碍［1］。痛风消停汤具有清热解毒、利湿泄浊、化瘀通络之功，治疗痛风有较好临床疗效。我们观察了痛风消停汤对AGA大鼠踝关节滑膜组织炎性因子的影响，总结如下。

1　材 料

动物：清洁级雄性S D大鼠6 0只，体质量（200±20）g，由重庆医科大学实验动物中心提供［动物合格证号SCXK（渝）2012-0001，环境合格证号SYXK（渝）2012-0001］。

药品与试剂：痛风消停汤由茵陈、苦参、苍术、车前子、当归、黄精、秦艽、寻骨风、络石藤等中药组成，原药购自重庆西部医药商城有限责任公司，由重庆医科大学中医药学院鉴定，按常规方法自制煎剂，即冷水浸泡30min，煮沸后煎30min，共煎3次，合并药液，浓缩为含生药1.0g /mL煎剂。秋水仙碱片（昆明制药集团股份有限公司），尿酸钠晶体（美国SIGMA公司），白细胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）、白细胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α））ELISA试剂盒（南京建成生物工程研究所），S-P Rabbit HRP Kit （DAB）兔Streptavidin-HRP试剂盒（武汉博士德生物科技有限公司），TGF-β1、TGF-βR1 一抗（武汉博士德生物科技有限公司）等。

仪器：AU400全自动生化分析仪，日本OLYMPUS公司；BX51T-PHD-J11型显微镜，日本OLYMPUS 公司；80-2型低速离心机，上海手术器械厂；图像采集系统CMOS，日本OLYMPUS 公司；Image-Pro Plus，美国Media Cybernetics公司；RM2015型切片机，德国莱卡等。

2　方 法

2.1动物造模与分组

取雄性SD大鼠60只适应性饲养1周后，随机分为正常组，模型组，秋水仙碱组，痛风消停汤低、中、高剂量组，每组10只。造模前2日开始，按20mL/kg体质量予以生理盐水灌胃，1日1次，直至造模后7日，连续9日。秋水仙碱组用秋水仙碱混悬液0.3mg/kg灌胃，痛风消停汤低、中、高剂量组分别按2、4、8g/kg体质量给予痛风消停汤灌胃，均从造模前2日开始，1日1次，直至造模后第7日，连续9日。根据文献方法［2］加以改进，除正常组大鼠外，其余各组大鼠从灌胃第3天开始，大鼠腹腔注射10%水合氯醛溶液麻醉后，在大鼠右踝关节后侧用6号注射针针口斜面与胫骨成45°夹角方向插入跟腱内侧直至踝关节腔，将配置好的（浓度为2.5g/100mL）0.2mL的尿酸钠溶液注入关节腔内，以关节囊对侧鼓胀为注入标准，连续7天。正常组注射同体积生理盐水，连续7天。

2.2标本采集与指标检测

大鼠血尿酸检测。大鼠处置符合中华人民共和国科技部2006年颁布的《关于善待实验动物的指导性意见》。造模第7日，灌胃2h后，按20%乌拉坦5mL/kg体质量进行麻醉，摘取眼球采血3-5mL，静置1-2h，4000r/min离心10min，分离血清，取上清液，低温（4℃）保存，按说明书检测血尿酸。

ELISA法检测大鼠踝关节IL-1β、IL-6、TNF-α等的含量。颈椎脱臼处死大鼠，以踝关节为中心上下0.5cm处剪断，取下受试关节及周围软组织，快速切取踝关节滑膜组织，称重，按1∶5比例加生理盐水稀释，4℃匀浆，4000r/min离心5min，取上清液，分装于Ep管中，按ELISA试剂盒说明书检测关节滑膜组织浸出液中IL-1β、IL-6、TNF-α等的含量。

免疫组化SABC法检测大鼠踝关节TGF-β1及TGF-βR1的表达。以受试踝关节为中心上下0.5cm处剪断，取相应关节组织放入4%多聚甲醛中固定，石蜡包埋、切片。根据免疫组化试剂盒说明书，ABC染色，DBA显色，复染、脱水、透明、封片，以显微镜下细胞胞浆及胞膜内出棕色粒为阳性表达，免疫组化结果采用IHS （immunohistochemical scores）评分：阳性细胞百分比为A，阳性细胞染色强弱为B，IHS = A×B。无阳性细胞则A为0分，阳性细胞为1%～10%则A为1分，阳性细胞为11%～50%则A为2分，阳性细胞为51%～80%则A为3分，阳性细胞为80%～100%则A为4分。染色强度阴性B 为0分，弱阳性为1分，阳性为2分，强阳性为3分［3］。

2.3统计学处理

采用SPSS 17.0软件对各组数据进行统计分析，数据以（±s） 表示、采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

3　结　果

大鼠血尿酸及及受试踝关节滑膜组织IL-1β、IL-6、TNF-α含量比较见表1。

表1　各组大鼠血尿酸及受试踝关节滑膜组织IL-1β、IL-6、TNF-α含量比较 （±s）

表1　各组大鼠血尿酸及受试踝关节滑膜组织IL-1β、IL-6、TNF-α含量比较 （±s）

注：与正常组比较，△P＜0.05；与模型组比较，▲P＜0.05。

组别　n　 uric acid （μmol/L）　IL-1β（ng/L）　IL-6（ng/L）　TNF-α（ng/L）正常组　10　106.33±22.01　6.83±0.36　9.15±0.52　20.15±0.92模型组　10　186.72±43.36△　8.97±0.65△　32.57±0.65△　76.57±3.65△秋水仙碱组　10　135.49±32.25△▲　7.44±0.58△▲　17.41±0.59△▲　33.41±1.59△▲痛风消停汤低剂量组　10　138.53±29.74△▲　7.93±0.21△▲　15.62±0.72△▲　35.62±2.72△▲痛风消停汤中剂量组　10　131.26±24.55△▲　7.31±0.83△▲　15.28±0.43△▲　31.78±2.18△▲痛风消停汤高剂量组　10　129.81±35.67△▲　7.28±0.54△▲　14.06±0.41△▲　29.06±1.33△▲

大鼠受试踝关节TGF-β1、TGF-βR1表达比较见表2。

表2　各组大鼠受试踝关节滑膜组织TGF-β1、TGF-βR1表达比较（±s）

表2　各组大鼠受试踝关节滑膜组织TGF-β1、TGF-βR1表达比较（±s）

注：与正常组比较，△P＜0.05；与模型组比较，▲P＜0.05。

组别　n　 TGF-β1　 TGF-βR1正常组　10　 2.14±0.05　 2.79±0.13模型组　10　 2.45±0.12　 3.12±0.11秋水仙碱组　10　 2.29±0.16　 2.93±0.17痛风消停汤低剂量组　10　 4.01±0.12△▲　4.39±0.12△▲痛风消停汤中剂量组　10　 4.13±0.26△▲　4.18±0.13△▲痛风消停汤高剂量组　10　 4.09±0.17△▲　4.96±0.21△▲

4　讨　论

痛风消停汤方中茵陈、苦参清热解毒，苍术、车前子利湿泄浊，秦艽、寻骨风、络石藤祛风除湿、化瘀通络止痛，当归、黄精养血填精和营以固正气。全方有清热解毒、利湿泄浊、化瘀通络之功。药理研究表明，茵陈有降脂利尿、抗多种病原微生物作用。苦参碱对各种致炎剂引起的急性渗出性炎症有明显对抗作用，与氢化可的松作用相似。苍术、车前子的提取液可抗炎利尿，且有预防肾结石等作用。当归有镇痛，抗菌，抗氧化和提高免疫力等作用。黄精则可提高机体的免疫力。秦艽解热、镇痛、抗炎，可消除大鼠关节肿胀。寻骨风所含生物碱对类风湿关节炎有较好止痛、消肿、改善关节功能等作用。络石藤甲醇提取物对动物双足浮肿、扭体反应有抑制作用，所含尿酸合成酶黄嘌呤氧化酶有显著抑制作用而能抗痛风。茵陈、苍术、车前子、黄精等均有降低血尿酸的水平等作用［4］。

研究表明，在痛风性关节炎的病理过程中，尿酸钠晶体作用于中性粒细胞、滑膜细胞、T细胞、单核细胞、巨噬细胞、血小板释放多种炎症介质，如炎性细胞因子、组胺、前列腺素、血小板活化因子（PAF）、微血管增渗酶等，而多种细胞因子可通过自分泌和旁分泌的方式影响痛风性关节炎的发生［5］，其中免疫活性因子TNF-α和白细胞介素-1β（IL-1β）在AGA发病过程中起着非常重要的作用。中性粒细胞-内皮细胞粘连是急性痛风产生的本质，而TNF-α和IL-1β可上调内皮细胞E-选择素活性及增加中性粒细胞的募集，活化的中性粒细胞与内皮细胞表面黏附分子黏附，进而向关节部位浸润，释放炎性介质，引起AGA关节局部炎症反应的发生［6］。有人认为，TNF-α和IL-1β两因子作为炎症的启动因子，通过与滑膜细胞上IL-1受体相互作用，激活结头蛋白MyD88，继而启动NF-κB触发继发性的炎性细胞因子转录，从而加重关节损伤［7］；TNF-α也是前炎症网链中一级细胞因子，IL-1β是由TNF-α等诱导的二级前炎症细胞因子，并能提高TNF-α的活性，两者之间可能存在反馈机制，共同参与内皮细胞的激活和炎性细胞在体内的募集而加重炎性损伤［8］。因此，降低AGA关节组织中TNF-α和IL-1β的水平，终止炎性细胞因子的恶性循环，则是有效治疗AGA的作用环节之一。转化生长因子β（TGF-β）是一类在发育、免疫反应和组织修复中起调节作用的生长和分化因子，其具有双向性、多样性和网络性，在免疫、炎症及纤维化性疾病中有重要作用。而转化生长因子-β1（TGF-β1）是骨关节炎的一个主要调节因子，不仅具有促进炎症与组织修复的活性，还可以抑制IL-1、IL-6的合成与致炎活性，使干扰素-a（IFN-a）、IFN-γ等的表达降低，有抑制炎症活性的功能。TGF-β1的增加能抑制AGA患者IL-1β和TNF-α等促炎因子［9］，提示TGF-B1的增高可能抑制了AGA的炎症反应。TGF-β是通过转化生长因子β受体（TGF-βR）的信号调节系统作为重要媒介作用于细胞的，因此可通过增加TGF-βR1的含量有效增强TGF-β1对组织器官发挥作用。此外，TGF-β1还可促进蛋白多糖合成，促进关节软骨合成，促进成纤维细胞I型胶原基因表达，且无疤痕形成［10］。

实验结果表明，用痛风消停汤后，各组大鼠血尿酸、受试踝关节滑膜组织中IL-1β、IL-6、TNF-α含量降低，TGF-β1及TGF-βR1表达提高，提示痛风消停汤治疗急性痛风性关节炎的机制可能与上调TGF-β1及TGF-βR1的表达、抑制IL-1β、IL-6、TNF-α的含量有关，但其机制还有待进一步研究。

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［9］Yu-Hsuan Chen，Song-Chou Hsieh et al.Spontaneous resolution of acute gouty arthritis is associated with rapid induction of the antiinflammatory factors TGFβ1，IL-10 and soluble TNF receptors and the intracellular cytokine negative regulators CIS and SOCS3［J］.Ann Rheum Dis，2011，70:1655–1663.

［10］何炜，郭亭，赵建宁.转化生长因子β与骨关节炎的软骨损伤修复［J］.医学研究生学报，2007，20 （2）：195.

［收稿日期］2015-07-23

［通讯作者］黄学宽

［基金项目］重庆市卫生局科技项目（2010-2-25）

［中图分类号］R255.689.7

［文献标识码］B

［文章编号］1004-2814（2015）10-0888-03