白藜芦醇对脓毒症大鼠急性肺损伤的治疗作用及机制

周继红，韦晓谋，陈宏，兰慧慧，郑妮，李金万(柳州市工人医院，广西柳州 545005)

白藜芦醇对脓毒症大鼠急性肺损伤的治疗作用及机制

周继红，韦晓谋，陈宏，兰慧慧，郑妮，李金万(柳州市工人医院，广西柳州 545005)

摘要：目的观察白藜芦醇(Res)对脓毒症大鼠急性肺损伤(ALI)的治疗作用，并探讨其可能的机制。方法60只Wistar大鼠，随机分为假手术组(Sham组)、脓毒症组(Sep组)、Res组各20只。Sep组和Res组采用盲肠结扎穿刺术制备脓毒症相关性ALI大鼠模型，Sham组除不作环形结扎和针刺穿孔外，其余操作均与Sep、Res组相同。各组大鼠术毕均皮下注射生理盐水30 mL/kg抗休克。造模1 h后，Res组大鼠股静脉注射40 mg/kg的Res液2 mL，Sham、Sep组给予等量生理盐水。各组在造模后2、6、12、24 h分别采用颈椎脱臼处死5只大鼠，取大鼠肺组织，HE染色观察其病理形态，RT-PCR法检测肺组织高迁移率族蛋白B1(HMGB1)、Toll样受体4(TLR4)mRNA，Western blotting法检测HMGB1、TLR4蛋白。结果与Sep组相比，Res组造模后12 h肺组织病理变化有所减轻；造模后24 h各种病理改变明显减轻，部分肺组织开始接近正常形态。与Sep组相比，Res组造模后2、6、12、24 h肺组织HGMB1、TLR4 mRNA及蛋白表达均下调(P均<0.05)。结论Res可以减轻大鼠脓毒症诱导的肺损伤，其机制可能与下调肺组织HGMB1和TLR4 mRNA、蛋白表达有关。

关键词：白藜芦醇；脓毒症；急性肺损伤；高迁移率族蛋白B1；Toll样受体4

脓毒症是在全身炎症反应综合征(SIRS)基础上合并的感染，常导致全身重要脏器发生严重病理、生理改变，是现代危重病医学面临的难题，伴有脓毒症休克及多器官功能障碍的患者病死率可高达80%～90%[1]。在脓毒症并发的器官损伤中，肺是受损最严重的器官，主要表现为急性肺损伤(ALI)或急性呼吸窘迫综合征。白藜芦醇(Res)是虎杖的根茎提取物，属于非黄酮类多酚化合物，具有抗肿瘤、抗氧化、抗炎等生物学活性，可下调各种炎症介质的合成和分泌[2~4]。高迁移率族蛋白B1(HMGB1)是脓毒症致病的晚期关键性因子，Toll样受体4(TLR4)作为HMGB1的重要受体参与HMGB1的信号转导[5]。本研究观察了Res对脓毒症大鼠ALI的治疗作用，并探讨其机制。

1材料与方法

1.1实验动物分组及处理 SPF级Wistar大鼠，雄性，13～15周龄，体质量200～250 g，共60只，由广西医科大学实验动物中心提供，动物合格证号：SCXK(桂2013-0008)。按随机数字表法将大鼠分为假手术组(Sham组)、脓毒症组(Sep组)和Res组，每组20只。Sep、Res组根据Rittirsch等[6]定义的盲肠结扎穿刺术(CLP)的标准化程序制备脓毒症实验模型，以戊巴比妥钠(50 mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠，麻醉满意后以碘伏常规消毒腹部区域，剃去腹部毛发，铺无菌洞巾，沿腹正中线作一长约1 cm纵行切口，以无菌镊探查并暴露盲肠，在距盲肠末端约1 cm处结扎盲肠，以27号针头垂直盲肠肠管贯通穿刺3次并挤出少量肠内容物至腹腔内，将穿刺后的盲肠还纳腹腔，逐层缝合，造模时间控制在10 min以内。Sham组除不作环形结扎和针刺穿孔外，其余操作均与Sep、Res组相同。各组大鼠术毕均给予皮下注射生理盐水30 mL/kg抗休克。Sep组造模后1 h股静脉注射生理盐水2 mL；Res组股静脉注射40 mg/kg的Res(购自广东广弘药材有限公司，并由广西医科大学中药鉴定室鉴定为正品)2 mL。本实验中动物处置方法符合动物伦理学标准。

1.2标本收集及处理各组大鼠在造模后2、6、12、24 h分别颈椎脱臼处死5只大鼠，取右下肺组织，部分肺组织置于-80 ℃冰箱保存，用于测定HMGB1、TLR4 mRNA；部分肺组织用4%中性甲醛溶液固定，用于病理观察。

1.3各组大鼠肺组织病理形态观察取大鼠肺组织，常规脱水，浸蜡，石蜡包埋，切片厚度3～4 μm，行HE染色，Olympus BX51显微镜观察并采集图像。

1.4各组大鼠肺组织HMGB1、TLR4 mRNA检测 采用RT-PCR法。所有引物均由TaKaRa公司设计并合成，设计软件为Primer premer。取肺组织50 mg，每个待检标本设3个平行孔，按TRIzol法常规提取细胞总RNA，反转录合成cDNA，使用ABI 7500荧光定量PCR仪进行扩增，结果由ABI 500 PCR仪自动生成，计算HMGB1、TLR4 mRNA的相对表达量。

1.5各组大鼠肺组织HMGB1、TLR4蛋白检测采用Western blotting法。取大鼠肺组织50 mg，按照试剂盒说明提取总蛋白。取等质量的样本蛋白(30 μg)，进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(初始电压80 V，后改为100 V,各1 h)；将标本蛋白转移至PDVF膜上；TBST洗涤3次，每次5 min；加入TBST稀释的一抗(兔抗HMGB1,1∶200稀释；兔抗TLR4，1∶100稀释)，4 ℃摇床过夜。TBST洗涤3次，每次10 min；加入荧光标记的二抗工作液(1∶3 000)，室温下避光振荡1 h。TBST洗涤3次，每次10 min。用KODAK成像系统曝光获取图像，利用该成像仪绑定的软件分析灰度值，进行定量分析，以条带灰度值的比值作为该组样品蛋白水平的相对表达量。

2结果

2.1各组大鼠肺组织病理形态镜下观察可见，造模后2 h，各组大鼠肺组织均未见明显异常。Sham组大鼠在6 h可见轻度灶性肺间质或肺泡水肿，肺血管内中性粒白细胞开始聚集；12 h达高峰；24 h炎症几乎完全消退，但各时间点变化均较Sep组大鼠轻。Sep组大鼠在6 h可见肺组织重度炎性反应，血管充血，间质水肿出血，肺泡坏死，肺泡腔范围消失，淋巴细胞、中性粒细胞、巨噬细胞等炎性细胞浸润；12 h达到高峰。Res组大鼠在12 h可见与Sep组相似的病理变化，但与Sep组相比有所减轻；24 h后肺组织炎性反应病灶明显减少，肺泡水肿、肺出血、肺实变和中性粒细胞浸润明显减轻。

2.2各组大鼠肺组织HMGB1及TLR4 mRNA、蛋白表达比较结果见表1。

表1　各组大鼠肺组织HMGB1及TLR4 mRNA、蛋白表达比较

注：与Sham组比较，*P<0.01；与Sep组比较，△P<0.05，#P<0.01。

3讨论

由肺外因素所致的ALI常常预示患者第一个器官功能障碍的开始，其中非肺源性脓毒症是最常见原因[7]。HMGB1具有“晚期”炎症介质的作用，参与脓毒症的后期病理生理发展过程[8]。当炎症刺激细胞坏死或受损时，核内的HMGB1可释放到胞外，诱导单核细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、树突细胞等合成分泌促炎因子TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8等；而促炎因子又反过来促进HMGB1的分泌，同时HMGB1和炎症介质互为诱导，正反馈瀑布式扩大SIRS，并且在炎性反应的后期，这种正反馈效应对炎性反应的维持起到了相当重要的作用，引起多器官组织损伤，最终导致MODS。研究[9,10]发现，HMGB1出现较晚，大量释放约在炎症暴发后20 h，持续20～72 h后降低，与其他早期炎性因子不同的是，出现较晚的HMGB1能为临床提供较长的窗口期来治疗由它引发的重症炎症。TLR4作为HMGB1的重要受体参与HMGB1的信号转导，重组HMGB1诱导相关细胞释放致炎细胞因子，而使用TLR4中和抗体处理后致炎细胞因子释放受到明显抑制[11~13]。

Res对脓毒症肺损伤具有治疗作用，在脂多糖诱导的小鼠ALI模型中，Res能明显抑制肺部炎症因子的释放，减轻肺损伤程度[14,15]。在鼠类CLP诱导的大鼠脓毒症模型中，腹腔内给予Res能明显减少肺部炎症介质TNF-α及IL-6的产生，上调血红素氧合酶1的表达，减轻肺部的病理性损伤[16]。Res的生物学活性为治疗脓毒症提供了新思路，多数报道[17~20]认为其抗炎作用与其下调NF-κB和抑制TNF-α、IL-1β等早期炎症因子有关，但Res对晚期炎症介质HMGB1及其重要受体TLR4表达的影响如何鲜有报道。本实验中，相比于Sham组，Sep组肺组织病理损伤严重，细胞大量凋亡和坏死，大量的炎症细胞浸润，肺组织HMGB1及TLR4 mRNA、蛋白表达显著升高，且随时间的延长呈逐渐增加趋势，至术后24 h达高峰后下降。Res组Res干预后在整体水平减轻了脓毒症引起的ALI病理损伤，可以下调肺组织中HMGB1及TLR4 mRNA、蛋白表达。结果提示Res可以影响HMGB1及TLR4的表达，减轻炎症损伤及改善预后。

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(收稿日期：2014-11-28)

中图分类号：R563

文献标志码：A

文章编号：1002-266X(2015)11-0032-03

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2015.11.011