抑制奶牛乳腺炎致病菌的中药复方筛选及其抗炎效果研究

荣霞，王自力，张翥，涂君平，魏学良，金美兰，别应堂，张家骅

(1.西南大学动物科技学院，重庆 400716；2. 重庆市璧山区大兴镇畜牧兽医站，重庆 404000；3. 重庆市光大(集团)有限公司，重庆 400020)



抑制奶牛乳腺炎致病菌的中药复方筛选及其抗炎效果研究

荣霞1，2，王自力1，3*，张翥1，涂君平1，魏学良1，金美兰1，别应堂3，张家骅1

(1.西南大学动物科技学院，重庆 400716；2. 重庆市璧山区大兴镇畜牧兽医站，重庆 404000；3. 重庆市光大(集团)有限公司，重庆 400020)

为研究可有效抑制奶牛乳腺炎主要致病菌的中药复方及其抗炎效果，通过对黄连、黄柏、赤芍、苦参、连翘等5味中药进行正交试验设计组方，采用平板打孔法、试管二倍稀释法分别研究了各单味中药及其复方对金黄色葡萄球菌、停乳链球菌、无乳链球菌和大肠杆菌的体外抑菌效果，同时研究了筛选出的中药复方的不同剂型对二甲苯致小鼠耳肿胀的急性炎症和棉球致肉芽肿的慢性炎症的抑制效果。结果表明，对5味中药的敏感性强弱依次为对无乳链球菌、停乳链球菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌；中药方剂3和方剂7对4种细菌的体外抑菌活性较强，且以方剂3的搽剂及膏剂对急、慢性炎症具有良好的抑制效果。

奶牛乳腺炎；中药复方；抗菌；抗炎

目前，我国奶牛乳腺炎的发病率较高，临床型奶牛乳腺炎平均发病率为33.41%，隐性乳腺炎的平均阳性率为73.91%，乳房患病率为44.74%[1]，其主要致病菌为金黄色葡萄球菌、停乳链球菌、无乳链球菌和大肠杆菌[2-3]。虽然用抗生素治疗奶牛乳腺炎可取得较好的疗效，但易导致药物残留和耐药菌出现，严重危害奶业健康生产和公共卫生安全。因此，研制低毒、低残留且安全的中药制剂来防治奶牛乳腺炎是重要的研究热点之一[4]。本研究选取黄连、黄柏、赤芍、连翘、苦参等中药，研究中药及其复方对乳腺炎主要致病菌的体外抗菌活性及抗炎效果，为研制防治奶牛乳腺炎药物提供试验依据。

1 材料与方法

1.1 动物及分组 雄性昆明小鼠(22～25 g)70只，雌雄各半。随机分为7组：阴性对照组(基质搽剂组，基质软膏组)，阳性对照组(地塞米松组)，中药复方组(方剂3和方剂7)搽剂组及软膏组，每组10只。

1.2 药品与试剂 黄连、黄柏、赤芍、连翘、苦参，均购自重庆市桐君阁大药房。乙二胺四乙酸二钠、液态石蜡，甘油，三乙醇胺，吐温20、地塞米松、二甲苯、乙醚、单硬脂酸甘油酯、硬脂酸、白凡士林、十二烷基硫酸钠、羟苯乙酯等均购自成都市科龙化工试剂厂。

金黄色葡萄球菌，由西南大学动物科技学院微生物学实验室保存；无乳链球菌(CVCC1886)，停乳链球菌(CAU0586)，大肠杆菌(CVCC1560)，均购自中国兽药监察所菌种保藏中心。

1.3 仪器与设备 RE-52A型旋转蒸发器、GHP-9080型隔水式培养箱、THZ-C型恒温振荡箱、722S可见分光光度计、SW-CJ-1Bμ型无菌工作台。

1.4 方法

1.4.1 中药提取及制剂 参照文献方法[5]煎煮及提取药物，即称取相应中药，加水煮沸3次，双层纱布过滤后，分别经60%、80%无水乙醇于4℃醇沉12 h，3000 rpm离心15 min后，取上清液经减压旋转蒸发浓缩至1 g生药/mL。同时，参照文献[6]制作软膏基质，将中药提取液加入软膏基质混匀，制作成1 g生药/g基质的膏剂；另将乙醇、氮酮、吐温20、蒸馏水按一定比例制成搽剂基质，再与中药提取液配制成1 g生药/mL基质的中药搽剂，置于4℃保存。

1.4.2 正交试验设计 根据体外抑菌试验结果，考察黄连、黄柏、赤芍、连翘和苦参的醇沉水提物不同水平组方对奶牛乳腺炎主要致病菌的体外抑菌效果，选用正交表L8(25)。水平参照单味中药(因素)的最大MBC值，中药复方组成、水平和试验表头设计见表1和表2。

表1 中药复方组成因素和水平

表2 试验表头设计及方案

1.4.3 中药抑菌效果测定 参照文献方法[7]，采用平板打孔法进行测定。

1.4.4 中药最小抑菌浓度(MIC)和最低杀菌浓度(MBC)测定 参照文献方法[8]，采用二倍稀释法和平板计数法进行测定。

1.4.5 抗炎效果研究

1.4.5.1 急性炎症的抗炎效果研究 采用二甲苯致鼠耳肿胀法[9]制作急性炎症模型。即在每只小鼠右耳涂抹二甲苯0.03 mL，致炎0.5 h后，基质组鼠左右耳涂抹基质；给药组鼠左耳涂抹基质，右耳涂抹复方中药制剂，给药4 h后，用直径为6.0 mm的打孔器分别在小鼠两耳同部位打下圆耳片，立即称重，分别计算肿胀度和肿胀抑制率。

耳肿胀度=M(右耳片)-M(左耳片)(M为质量)

肿胀抑制率(%)=[(对照组肿胀度-给药组肿胀度)/对照组肿胀度]*100%

1.4.5.2 慢性炎症的抗炎效果研究 采用小鼠棉球肉芽肿法[9]制作慢性炎症模型。即用乙醚吸入麻醉小鼠后，于无菌操作条件下将灭菌棉球(5mg)分别植入小鼠左右腋窝皮下，缝合皮肤；于术后次日给各组小鼠腋下棉球皮肤处均匀涂抹0.03mL药物搽剂或0.03g药物膏剂，连续给药7d，每天2次。末次给药1h后颈部脱臼处死小鼠，取出各组棉球肉芽组织，剔除脂肪组织后于80℃烘干12h至恒重，按如下公式计算肉芽肿组织重及增生抑制率：

肉芽组织重=植入棉球肉芽肿平均重量-植入棉球初重

增生抑制率(%)=[(对照组肉芽肿重量-给药组肉芽肿重量)/对照组肉芽肿重量]*100%

1.5 数据处理及分析 数据采用SPSS19.0分析软件进行统计分析，以平均值±标准差(x±SD)形式表示。

2 结果

2.1 单味中药及其复方体外抑菌效果 由表3可知，金黄色葡萄球菌对5种中药的敏感度顺序为：黄连、赤芍、苦参、连翘；无乳链球菌的敏感度顺序为黄连、赤芍、连翘、黄柏、苦参，且对除苦参外的4味中药高度敏感；停乳链球菌的敏感顺序为黄连、黄柏、连翘、赤芍；大肠杆菌的敏感顺序为黄连、赤芍、连翘；黄柏仅对链球菌有抑制作用；苦参仅对金黄色葡萄球菌和无乳链球菌有抑制作用。

表3 5种中药提取物对奶牛乳腺炎主要致病菌的抑菌效果(mm)

注:”—”表示无抑菌圈。所打孔孔径为7 mm，抑菌直径<10 mm为低度敏感，10～14 mm为中度敏感，15～19 mm为高度敏感，20 mm及以上为极敏，下同。

由表4可知，黄连对四种致病菌的MIC值最低，在0.0078～0.0625 g/mL之间。总体而言，5味中药对链球菌的MIC值较低，尤其是黄连和黄柏；苦参的抑菌范围较窄，仅对金黄色葡萄球菌有一定抑制作用，MIC为0.25 g/mL。

表4 5种中药提取物对奶牛乳腺炎主要致病菌的抑菌效果(g/mL)

由表5所示，8个中药复方对4种供试菌株均表现一定程度的抑制作用。其中，以方剂1、方剂3、方剂4、方剂7对金黄色葡萄球菌的MIC值较小，以方剂1、方剂3、方剂4对无乳链球菌的MIC值较小，以方剂1、方剂3、方剂5、方剂7对停乳链球菌的MIC值较小，以方剂2、方剂3、方剂7对大肠杆菌的MIC值较小；以方剂1、方剂3、方剂7对金黄色葡萄球菌的MBC较小，为方剂3、方剂4、方剂5对无乳链球菌的MIC值较小，以方剂1、方剂3、方剂5、方剂6、方剂7、方剂8对停乳链球菌的MIC值较小，以方剂4、方剂1、方剂3、方剂7对大肠杆菌的MBC值较小。因此可知，以方剂3和方剂7对各致病菌具有较好的抑制作用。

表5 中药提取物复方对奶牛乳腺炎主要致病菌的抑菌效果(g/mL)

由表6可知，直观分析结果表明，对金黄色葡萄球菌的5味中药的两水平间极差均为0，各因素之间无主次之分；对无乳链球菌，黄连、赤芍和连翘的水平极差较大，最佳组方为A1B2C1D1E1；对停乳链球菌，黄柏、赤芍、连翘的水平极差较大，最佳组方为AB2C1D1E；对大肠杆菌，苦参的水平极差较大，且以1水平对大肠杆菌的抑制作用最强，最佳组方为A1B2C2D1E1。根据对以上各菌影响的主次顺序综合分析可知，中药最佳组方为A1B2C1D1E1，最为接近的为方剂3(A1B1C1D1E1)。

2.2 中药提取物复方的抗炎效果研究

2.2.1 对急性炎症的抗炎效果

表6 不同组成的中药提取物复方对奶牛乳腺炎主要致病菌抑菌效果的直观分析

续表

注：表中a代表金黄色葡萄球菌，b代表无乳链球菌，c代表停乳链球菌，d代表大肠杆菌。

由表7可知，与基质组相比，方3和方7搽剂组小鼠耳肿胀度均极显著低于基质组(P<0.01)，肿胀抑制率分别为54.7%、49.8%且低于地塞米松组；而方剂3和方剂7膏剂组与基质组小鼠耳肿胀度无显著差异(P>0.05)。

2.2.2 对慢性炎症的抗炎效果

表7 中药提取物复方对二甲苯致小鼠耳肿胀的影响(n=10)

注：与基质组相比，*表示差异显著(P<0.05)，**表示差异极显著(P<0.01)，下同。

由表8所示，与基质组相比，方剂3和方剂7搽剂组小鼠肉芽肿重量均低于基质组，但无显著差异(P>0.05)；方剂3软膏组小鼠肉芽组织重显著低于基质组(P<0.05)，肿胀抑制率为40.4%，方剂7膏剂组则无显著差异(P>0.05)。

表8 中药提取物复方对小鼠棉球致肉芽肿的影响(n=10)

3 讨论与小结

根据中兽医理论可知，奶牛乳腺炎是由于胃热壅盛、气血凝滞、胃脉受阻、乳腺静脉阻塞或不畅而发生的[10]。从病原学上看，奶牛乳腺炎是由微生物感染引起的，其中以金黄色葡萄球菌、链球菌、大肠杆菌为主，占感染病例的90%以上。因此，针对奶牛乳腺炎的发病机制和发病特点，本研究选用了具有清热解毒、抗菌消炎、活络通乳、消肿等功效的黄连、黄柏、赤芍、连翘和苦参[11]，比较各单味药及其复方对奶牛乳腺炎主要致病菌的体外抑菌活性强弱及抗炎效果。

3.1 单味药及复方的体外抑菌效果

本研究采用平板打孔法和二倍稀释法考察5种中药对奶牛乳腺炎主要致病菌的体外抑菌活性，以确定各致病菌对不同中药的敏感性及敏感程度。有研究表明，连翘、黄柏、黄连对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌及链球菌具有抑菌作用[12]，且黄连主要有效成分小檗碱具有体内抑菌效果[13]。试验结果表明，黄连、黄柏、赤芍、连翘、苦参等5味清热药对革兰氏阳性菌的抗菌活性强于革兰氏阴性菌。其中，以黄连的抑菌活性最强，对四株致病菌均表现为高敏，连翘、赤芍的对大肠杆菌抑菌活性较强，苦参对金黄色葡萄球菌具有一定抑制作用，黄连、黄柏、赤芍、连翘对链球菌抑制作用较好。

通过正交设计进行组合中药复方，考察复方对奶牛乳腺炎致病菌的MIC和MBC，MIC值越小，抑菌活性越强。本研究表明，各个复方对4种奶牛乳腺炎致病菌均有较强的抑菌活性。根据中兽医学理论选用的中药组成的中药复方制剂对隐性乳房炎有一定的治疗效果[14]。直观分析得出，最佳组方为A1B2C1D1E1，即以方剂3对各菌的体外抑菌效果较好。方剂3的各单味中药浓度均为最大水平，即一定浓度范围内，中药浓度越高，抑菌活性增强。此外，方剂3的浓度比例为2∶2∶2∶2∶1，方剂7的浓度比例为1∶1∶1∶2∶1，即黄连：黄柏：赤芍为1∶1∶1，其配比可能具有协同作用，同时这三味中药分别对四种菌有较强的抑菌活性，在复方中发挥着重要的协同抑菌作用。因此，本研究选用方剂3、方剂7作为受试中药复方进行抗炎试验。

3.2 不同剂型中药复方的抗炎效果

目前防治奶牛乳腺炎的药物剂型以透皮剂为主，中药透皮给药具有疗效好、毒副作用小、无肝首过效应等优点[15]，对治疗奶牛乳腺炎有广阔的临床应用前景[16]。在本研究中，采用氮酮为透皮促渗剂制作中药复方搽剂，同时制作膏剂以研究其抗炎效果。

本研究表明，针对二甲苯引起小鼠耳廓肿胀的急性炎症，中药复方搽剂效果优于膏剂，且以方剂3效果最好；针对干棉球引起的肉芽肿的慢性炎症，中药复方膏剂效果优于搽剂，亦以方剂3效果最好。研究表明，氮酮作为透皮剂，可迅速渗入皮肤角质层，脱去细胞间脂质形成孔道，增加角质层含水量，降低角质层的相转变温度，增强药物的渗透作用[17]。因此，中药搽剂具有药物吸收较快、药效快、对急性炎性效果较好的特点；而膏剂具有药物作用时间长、药效稳定特点，主要用于慢性疾病的治疗[18]，故对慢性炎症效果较好。

同时，方剂3的搽剂及膏剂抗炎效果均优于方剂7，且方剂3中黄连、黄柏及赤芍药物含量高于方剂7。根据文献报导，黄连的主要有效成分是黄连碱，具有抑制LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞炎症反应作用；黄柏煎剂具有明显的抗炎效果[19]；且赤芍具有抗炎、镇痛功效[20]，因此，说明复方中黄连、黄柏及连翘的药物含量对抗炎效果影响较大。

黄连、黄柏、赤芍提取物对金黄色葡萄球菌、停乳链球菌、无乳链球菌和大肠杆菌具有较强的体外抑菌活性，以中药方剂3和方剂7的体外抑菌活性最强，且以方剂3对小鼠急、慢性炎症的抑制效果最好，而单味中药及其复方的体内抑菌效果及抗炎机制尚需进一步研究。

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(编 辑：陈希)

Screening of Chinese Medicine Formula and Anti-inflammatory Effects of Chinese Medicine Formula with Antibacterial Activity to Mastitis Pathogens

RONG Xia1,2, WANG Zi-li1,3*, ZHANG Zhu1,TU Jun-ping1,WEI Xue-liang1, JIN Mei-lan1, BIE Ying-tang3, ZHANG Jia-hua1

(1.CollegeofAnimalScienceandTechnology,SouthwestUniversity,Chongqing400716,China; 2.DaxingTownanimalhusbandryandveterinarystationofBishancountyofChongqing404000,China; 3.ChongqingGondaGroupCo.，Ltd.,Chongqing400020,China)

In order to screen of Chinese herb extracts formula with anti-bacterial effects to major mastitis pathogens, then to study its anti-inflammatory effect, the experiment was carried out to learn the Chinese herbs including berberine, cork, red peony, sophora, forsythia designed in different Chinese medicine formulas by orthogonal test, and then to investigate the antibacterial effect of each single herb and their formulas againstStaphylococcusaureus,Streptococcusdysgalactiae,StreptococcusagalactiaeandE.coliinvitroby plate diffusion method, tube dilution method and plate count method. Also the inhibitory effect of different dosage forms of Chinese medicine formulas on xylene-induced ear edema in mice with acute inflammation and cotton induced chronic granulomatous inflammation are studied. The results show that the sensitivity of 4 bacteria to the 5 herbs were successivelyStreptococcusagalactiae,Streptococcusdysgalactiae,StaphylococcusaureusandE.coli, the formula 3 and 7 exhibit with strong antibacterial activity and the formula 3 has a good anti-inflammatory effect to acute and chronic inflammation.

mastitis; Chinese herbal compound; antibacterial; anti-inflammatory

重庆市应用开发计划项目(cstc2014yykfB10001)；重庆市博士后特别资助项目(XM20120050)，西南大学2014年学科团队建设项目(2362014xk18)

荣霞，硕士研究生，从事动物产品检验检疫方面研究。

王自力。E-mail: wzl9698@126.com

2015-07-10

A

1002-1280 (2015) 08-0025-07

S853.76