犬细小病毒VP2基因编码主要抗原表位区的核酸免疫及其免疫原性研究

吴 植，曹 斌，贺生中，戴建华，吴 迪

(1.江苏农牧科技职业学院，江苏 泰州 225300；2.南京农业大学 动物医学学院，江苏 南京 210095)

犬细小病毒病由犬细小病毒(Canine parvovirus，CPV)引起的一种急性传染病，临床主要表现为出血性肠炎、非化脓性心肌炎和白细胞减少症，是危害养犬业发展的主要疫病之一[1]。目前该病主要通过弱毒苗预防，但免疫效果不够理想[2-3]。CPV 主要由NS1、NS2、VP1 和VP2 这4 种编码蛋白构成，其中VP2 为主要衣壳蛋白，含有主要中和抗原表位[4]。Langeveld 等利用VP2 抗原表位的合成肽或表达VP2蛋白的重组植物病毒免疫犬，能够诱导特异性免疫应答，因此VP2 基因是构建DNA 疫苗首选的目的基因之一[5]。本实验依照Bloom 等[6]的研究结果，利用DNAStar 软件包中的Protean 程序对CPV VP2 蛋白多肽链亲水性和抗原指数等二级结构进行分析，确定了主要抗原表位区域，构建了CPV VP2 基因主要抗原表位真核表达载体，为进一步研究更高效的DNA 疫苗奠定基础。

1 材料和方法

1.1 主要实验材料及实验动物 限制性内切酶等工具酶、pMD18-T 载体购自宝生物工程(大连)有限公司；大肠杆菌DH5α 感受态细胞按常规方法制备；pVAX1 真核表达质粒、Lipofectamine 2000 转染试剂购自Invitrogen 公司；IRDyeTMconjugated goat antimouse IgG(羊抗鼠IgG-IRDye)购自美国RockLand 公司；Wizard DNA Clean-up System 购自美国Promega公司；鼠抗CPV 血清、pcDNA3-VP2(VP2 源于CPVYZ 株)、COS-7 细胞、VP2 重组蛋白均由江苏省动物疫病流行病学中心提供；6 周龄～8 周龄BALB/c 小鼠购自扬州大学比较医学中心。

1.2 VP2-228真核重组表达质粒的构建 利用Protean 程序对CPV VP2 蛋白亲水性和抗原指数进行分析，选择亲水性和抗原指数高的区域(VP2-228)，采用Primer Premier 5.0 软件设计引物F：5'-CC AAGCTT ACGATGGATGTCTTTGCCTCATCTG AAG-3'(斜体为Hin d Ⅲ酶切位点，下划线处为Kozak翻译起始序列)和引物R：5'-GC GGTACC CTATC TTGACATATTAGCAGATG-3'(斜体为KpnⅠ酶切位点，下划线处为终止密码子)。引物由宝生物工程(大连)有限公司合成。

以pcDNA3-VP2 为模板，采用引物F/R，PCR扩增VP2-228，通过Hin d Ⅲ和KpnⅠ双酶切克隆于pVAX1 中构建真核重组表达质粒pVAX1-VP2-228，并经测序鉴定。

1.3 细胞转染及表达产物鉴定 按照Lipofectamine 2000 转染试剂说明书方法，将pVAX1-VP2-228 转染于在12 孔板中生长至80 %～90 %单层的COS-7 细胞，并以转染空载体pVAX1 作为阴性对照和不作任何处理作空白对照。转染后48 h 用胰酶消化并收集转染后的COS-7 细胞，提取总蛋白。按照常规方法进行SDS-PAGE 分离，将目的蛋白转印至PVDF膜上，封闭液为含10 % BSA 的PBS，以鼠抗CPV血清为一抗(1∶100)，以羊抗鼠IgG-IRDye 为二抗(1∶10 000)，杂交信号用Odyssey Infrared Imaging System(LI-COR，Biosciences)在800 nm 波长下扫描进行western blot 鉴定。

1.4 动物免疫实验 将16 只6 周龄～8 周龄BALB/c雌性小鼠随机分成4 组，即pVAX1-VP2-228 免疫组、VP2 重组蛋白阳性对照组、空载体pVAX1 阴性对照组和生理盐水空白对照组，每组4 只。免疫前3 d 小鼠左后腿内侧肌肉注射盐酸布比卡因(0.5 mg/mL)50 μL 作预处理，接种剂量分别为2 mL(100 μg/只)、1 mL(100 μg/只)、2 mL(100 μg/只)和2 mL，接种部位为左后腿内侧肌肉，连续注射2次，每次间隔3 周，每次免疫前2 d 和免疫后14 d经眼眶后静脉丛采血分离血清，-20 ℃保存备用。

1.5 血清抗体效价的测定 采用微量血凝抑制(HI)测定抗体效价。先做血凝(HA)试验测定血凝价。HI试验前先将待检血清用pH7.2 的PBS 稀释后作倍比稀释，再向每孔加8 单位血凝抗原(CPV YZ 株)25 μL，振荡混匀后于37 ℃感作1 h，再加10 mL/L 猪红细胞悬液50 μL，经振荡混匀，于4 ℃静置2 h后观察结果，以能够抑制100 %红细胞凝集的最高血清稀释度为该血清的HI 效价。

1.6 淋巴细胞增殖试验 无菌采取小鼠脾脏，加RPMI 1640 培养基，将脾组织通过200 目铜网制成细胞悬液，离心弃上清液，利用培养基调节细胞至1×106个/mL。向96 孔板中加入细胞悬液50 μL/孔，再加入刺激物ConA 至终浓度为2 mg/L，对照孔加RPMI 1640 全培养基，每个样品做3 个重复，37 ℃继续培养48 h，每孔加入20 μL MTT 溶液(5 g/L)，继续培养3.5 h，每管加入150 μL 二甲亚砜(DMSO)溶液，使紫黑色结晶完全溶解。在1 h 内测定OD570nm值，计算刺激指数(SI)，SI=刺激组OD570nm/非刺激组OD570nm。

2 结果

2.1 VP2-228基因片段的克隆及鉴定 利用Protean 程序进行CPV(YZ 株)VP2 氨基酸序列的亲水性、抗原指数等二级结构分析，选择亲水性和抗原指数较高的氨基酸集中区，最终确定了主要抗原表位氨基酸区域为aa293～aa520，命名为VP2-228。以pcDNA3-VP2 为模板进行PCR 扩增，琼脂糖凝胶电泳检测显示目的片段约700 bp，与预期相符(图1)。将目的片段VP2-228 经Hin d Ⅲ和KpnⅠ双酶切克隆于pVAX1 中，构建重组质粒pVAX1-VP2-228，经琼脂糖凝胶电泳检测，结果显示与预期相符(图略)。测序结果显示与GenBank 中的犬CPV VP2 基因相同区域序列同源性为99.9 %。

图1 VP2-228 PCR 产物电泳结果Fig.1 Amplification of VP2-228 by PCR

2.2 细胞转染及表达产物鉴定 将pVAX1 和pVAX1-VP2-228 分别转染COS-7 细胞，提取总蛋白进行SDS-PAGE 检测，结果显示在约30 ku 出现一蛋白条带，与预期相符，而阴性对照和空白对照在此处无特异性条带出现。将重组蛋白转印PVDF 膜后以CPV 小鼠血清为一抗进行western blot 分析，也能检测到预期大小的30 ku 蛋白条带(图2)，表明VP2-228 在COS-7 细胞中获得表达，并且具有良好的反应原性。

2.3 血清抗体的检测 免疫小鼠分别于0 d、14 d、35 d 采血分离血清。HI 抗体检测结果显示，pVAX1-VP2-228 免疫组在免疫后14 d HI 抗体为2 log2，免疫后35 d(再次免疫后21 d)抗体水平达到4 log2。VP2 重组蛋白免疫组HI 抗体水平低于pVAX1-VP2-228 免疫组，但差异不显著(p>0.05)。在整个试验过程中，空白对照组和阴性对照组HI 抗体检测均为阴性(图3)。

图2 VP2-228 的western blot 分析Fig.2 Western blot analysis of VP2-228

图3 pVAX1-VP2-228 免疫小鼠的HI 抗体的测定Fig.3 Antibody response in pVAX1-VP2-228-immunized mice detected by HI assay

2.4 淋巴细胞增殖试验 为研究重组质粒在体内表达的VP2-228 是否具有一定的免疫原性，利用MTT法初步分析了免疫小鼠的脾淋巴细胞的增殖情况。数据显示pVAX1-VP2-228 免疫组淋巴细胞增殖反应显著高于对照组(p<0.05)，表明CPV VP2 主要抗原表位VP2-228 能够诱导机体产生特异性的细胞免疫反应(图4)。

图4 小鼠淋巴细胞增殖试验Fig.4 The results of mouse lymphocyte proliferation assay

3 讨论

CPV自1978 年被首次分离以来，已在世界范围内迅速传播，目前对该病的控制主要通过接种弱毒苗进行预防，但使用弱毒存在潜在的感染性和毒副反应。DNA 疫苗由于具有既可以诱导体液免疫应答又可以诱导细胞免疫应答的特点而倍受关注。VP2蛋白是细小病毒的主要衣壳蛋白，由其诱导产生的中和抗体能够保护动物免受CPV 感染，Gupta 等和谢之景等国内外学者构建DNA 疫苗的主要抗原基因为整个VP2[7-8]。为增强DNA 疫苗表达抗原的能力，提高动物机体抗原提呈细胞(APC)抗原加工提呈的效率，本研究并未选择整个VP2 基因，而是选择了VP2 的主要抗原表位区域，提高了DNA 疫苗免疫效率。

在DNA 疫苗的研发中，在疫苗主要抗原基因确定的前提下，选择合适的表达载体显得尤为重要，pVAX1 是由美国食品和药品管理委员(FDA)认可的应用于DNA 疫苗的表达载体，是一种非融合载体，要求插入序列中时必须包含一段kozak 的翻译起始序列和一个起始密码子(ATG)以引导正确的翻译，因此在设计引物的时候要予以考虑。至于终止密码子在设计引物的时候可以考虑，也可以不需要考虑，因为该载体在多克隆位点(MCS)中XbaⅠ后已经加有终止密码子。

免疫动物血清中和抗体效价的高低是评价该疫苗保护率的重要指标，本研究结果表明免疫35 d 后HI 抗体水平达到4 log2，根据邱薇等的研究结果，CPV 的HI 抗体水平与中和抗体水平呈正比线性关系，中和抗体约为6×HI，可推算中和抗体效价为1∶100，表明构建的DNA 疫苗能够激发机体产生较好的抗体免疫应答，具有一定的抵抗病毒感染的能力[9]。淋巴细胞增殖试验结果表明CPV VP2 主要抗原表位基因疫苗能够激发小鼠产生细胞免疫应答。以上研究结果表明构建的重组质粒pVAX1-VP2-228可以作为DNA 疫苗进一步研究，特别是开发新型分子免疫佐剂，以进一步提高体液免疫和细胞免疫应答的水平。

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