表达传染性喉气管炎病毒gB主要抗原表位区域重组新城疫病毒的构建

孙娜娜，王 琪，李慧昕，刘胜旺

(中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 兽医生物技术国家重点实验室/禽呼吸道病创新团队，黑龙江 哈尔滨 150001)

传染性喉气管炎(Infectious laryngotracheitis,ILT)是由ILT 病毒(ILTV)引起的鸡的一种急性呼吸道传染病[1]。该病的特征为上呼吸道及气管粘膜炎症，并导致感染的鸡产蛋下降、生长迟缓、死亡而造成严重的经济损失[2]。

ILTV 属于疱疹病毒科、α-疱疹病毒亚科，类传染性喉气管炎病毒群。ILTV 的基因组约为150 kb，含有76 个开放阅读框(ORF)，编码11 种糖蛋白[3]。其中糖蛋白B(gB)为主要囊膜糖蛋白，由883 个氨基酸组成(约100 ku)。gB 对病毒的吸附、穿入及细胞间传播具有重要作用[4-5]。此外，该蛋白能够诱导机体产生有效的免疫反应，属于ILTV 的主要保护性抗原。

目前，以新城疫病毒(NDV)疫苗病毒作为活病毒载体得到广泛的研究。NDV 作为病毒载体应用的优点包括：NDV 具有不分节段单股负链RNA，遗传相对稳定，仅有一个血清型，病毒株间发生重组及毒力返强可能性很小[6]；由于NDV 复制过程为RNA 到RNA，并在胞浆内完，不存在DNA 阶段及与细胞基因组整合的可能；NDV 疫苗可以同时诱导体液免疫、局部粘膜免疫及细胞免疫的形成，可通过饮水、喷雾、滴鼻、点眼或注射多种方式进行免疫；NDV 具有高滴度的鸡胚生长特性，生产成本低[7-8]。

本研究以NDV 弱毒疫苗La Sota 为活病毒载体构建截短表达ILTV LJS09 株gB 的NDV 重组病毒，为研制和开发传染性喉气管炎重组新城疫二价活疫苗奠定基础。

1 材料和方法

1.1 主要实验材料 ILTV LJS09 由本实验室分离鉴定；表达T7 聚合酶的重组痘病毒vTF-3 和NDV感染性克隆pBR-FL 由本研究所人畜共患病实验室惠赠；稳定表达T7 聚合酶的BSR-T7/5 细胞系、LMH 细胞系、表达辅助核蛋白(pCI-neo-NP)、磷蛋白(pCI-neo-P)和大聚合酶蛋白(pCI-neo-L)的重组质粒及抗ILTV gB 的多抗血清均由本实验室保存；9 日龄SPF 鸡胚由本研究所实验动物中心提供。

1.2 主要试剂 质粒提取试剂盒及胶回收试剂盒购自Omega 公司；限制性内切酶、T4 DNA 连接酶购自NEB 公司；病毒RNA、DNA 提取试剂盒、DNA Marker 及Ex Taq DNA 聚合酶购自TaKaRa 公司；磷酸钙转染试剂盒购自Invitrogen 公司；G418、TPCK、FITC 标记的羊抗兔IgG(IgG-FITC)购自Sigma 公司。

1.3 引物设计与合成 根据GenBank 中登录的ILTV LJS09 基因序列设计用于扩增gB 主要抗原表位区基因的引物P1/P2，序列为：5'-GCGTTTAAA CttagaaaaaaTacgggtagaaC gccacc ATGCAATCCTACATC GCCGTGAACATTGAC-3'/5'-CGGTTTAAACTTTAGG CTTGGCGACGCTCTCTCCCTCTCGG-3'。引物加下划线部分为引入的PmeⅠ酶切位点，小写字母分别为加入的基因终止信号和基因起始信号，小写斜体部分表示Kozark 序列。

1.4 目的基因的扩增及感染性c DNA克隆的构建采用DNA 提取试剂盒提取感染ILTV LJS09 的LMH细胞的病毒DNA，以提取的ILTV LJS09 基因组DNA 为模板，以P1/P2 为引物进行PCR 扩增。反应条件：95 ℃5 min；94 ℃30 s、58 ℃30 s、72 ℃80 s，25 个循环；72 ℃10 min。PCR 产物经1 %凝胶电泳检测，利用DNA 凝胶回收试剂盒纯化PCR产物，得到的目的片段命名为gB1-440。将gB1-440片段进行PmeⅠ酶切，回收纯化gB1-440基因片段克隆于经PmeⅠ酶切的NDV 感染性克隆pBR-FL 中，构建含有gB1-440基因的NDV 感染性克隆，通过PCR 验证，筛选出正向连接的阳性重组质粒，命名为pBR-FL-gB1-440。

1.5 重组病毒的拯救 将痘病毒vTF-3 感染生长至50 %～80 %的BSR-T7/5 细胞，参照磷酸钙转染试剂说明书将pBR-FL-gB1-440以及pCI-neo-NP、pCIneo-P、pCI-neo-L 共转染BSR-T7/5 细胞。转染24 h后换成无血清的培养基并加入阿拉伯糖苷和TPCK，37 ℃继续培养72 h，收获培养物上清液，接种于9日龄SPF 鸡胚尿囊腔。第5 d 收获尿囊液进行NDV的血凝(HA)和血凝抑制试验(HI)。收获HA 和HI 均呈阳性结果的尿囊液，其中含有拯救的重组病毒，将拯救的重组病毒命名为rL-gB1-440。

1.6 重组病毒中gB1-440基因片段的检测 将rL-gB1-440在9 日龄SPF 鸡胚连续传20 代，每隔5 代按照RNA 提取试剂盒说明书提取尿囊液RNA。以RNA为模板，以P1/P2 为引物，进行RT-PCR 扩增，以鉴定rL-gB1-440中是否含有gB1-440基因。

1.7 重组病毒gB1-440基因表达的检测 分别将rL-gB1-440F3 代和La Sota 按照MOI 约为1 感染生长于6 孔板的BSR-T7/5 细胞，37 ℃培养至细胞病变(CPE)出现，经预冷的80 %丙酮在4 ℃固定20 min，以抗gB 抗体为一抗，以羊抗兔IgG-FITC 为二抗，进行间接免疫荧光(IFA)检测，荧光显微镜下观察鉴定结果。

1.8 重组病毒的生长动力曲线 将拯救病毒rL-gB1-440与亲本病毒的尿囊液按照100 EID50/0.1 mL接种量分别接种SPF 鸡胚尿囊腔，于接种后24 h、48 h、72 h、96 h 取样，每个时间点随机抽取3 枚鸡胚，收集尿囊液混匀后分别测定其EID50，绘制生长动力学曲线。

2 结果

2.1 gB1-440基因的扩增结果 以提取的ILTV LJS09 基因组DNA 为模板，以P1/P2 特异性引物进行PCR扩增，其产物经1 %琼脂糖凝胶电泳检测，目的片段约为1 300 bp，与预期相符(1 323 bp)(图1)。

图1 RCP 扩增gB1-440基因Fig.1 The amplification of gB1-440gene fragment by PCR

将ILTV LJS09 的gB1-440基因克隆于pBR-FL 的PmeⅠ位点，构建pBR-FL-gB1-440感染性重组质粒，经酶切鉴定，gB1-440基因正向连入。序列分析表明，与已知的序列一致。

2.2 重组病毒中外源目的基因的检测及稳定性鉴定以rL-gB1-440感染的5 代、10 代、15 代、20 代的鸡胚尿囊液提取的病毒RNA 为模板，RT-PCR 扩增得到约1 300 bp 片段，而NDV La Sota 株感染的鸡胚尿囊液中未扩增出任何的片段，表明gB1-440基因在rL-gB1-440中传代多次仍具有遗传稳定性(图2)。

2.3 rL-gB1-440病毒中gB1-440基因表达的鉴定 将rL-gB1-440与La Sota 分别感染BSR-T7/5 细胞，待出现CPE 时进行IFA 检测。结果显示rL-gB1-440感染细胞在以兔抗gB 血清为一抗的细胞孔内呈阳性荧光反应，而La Sota 感染的细胞以及正常细胞均呈阴性反应(图3)。

图2 RT-PCR 确定rL-gB1-440表达gB1-440基因的稳定性Fig.2 Confirmation of the gB1-440gene in the genome of rL-gB1-440viruses by RT-PCR

图3 感染rL-gB1-440的BSR-T7/5 细胞IFA 检测结果Fig.3 Detection of rL-gB1-440in infected BSR-T7/5 by IFA

2.4 重组病毒的生长动力学曲线 将重组病毒rL-gB1-440与亲本病毒分别按照100 EID50/0.1 mL 接种于9 日龄SPF 鸡胚，感染24 h、48 h、72 h、96 h时分别收取病毒尿囊液，计算病毒滴度绘制动力学曲线。结果显示，rL-gB1-440的生长动力学曲线与亲本病毒相似，病毒滴度在相同时间达到了峰值，基本保持了亲本病毒在SPF 鸡胚中的生长特性(图4)。

图4 rL-gB1-440复制动力学曲线Fig.4 Growth curve of rL-gB1-440in embryonated chicken eggs

3 讨论

目前，防制ILTV 主要措施为使用弱毒疫苗，但弱毒疫苗主要存在以下的不足：(1)疫苗病毒株的毒力与免疫原性呈正相关，现有疫苗的毒力偏强，接种反应大；(2)弱毒疫苗能够引起潜伏感染，潜伏感染的鸡群将终生带毒[9]；(3)疫苗病毒可以由接种鸡传染给非接种鸡，并且在鸡群与鸡群的传播过程中存在毒力返强的风险[10]；(4)目前仍无有效的鉴别强毒株和弱毒株的方法。因此，研究新型安全有效的疫苗用于防控ILTV 尤为重要。

近几年来，以NDV 为活载体构建新型基因工程重组疫苗得到了广泛的研究，研究结果表明重组NDV 具有较好的遗传稳定性，可以在多次传代后稳定表达外源基因，对动物具有较好免疫效果。Zhao等的研究表明插入ILTV 完整gB 基因的重组NDV不能完全保护ILTV 的攻击，推测可能是由于不充分的囊膜包裹以及细胞表面外源蛋白表达使得病毒不能诱发较强免疫诱导。同时，葛金英等的研究显示，外源蛋白的插入表达降低NDV 的致病力，其影响程度取决于插入基因的性质和长度[11]。因此，本研究在现有的NDV rLa Sota 疫苗株反向遗传操作技术的基础上，构建表达ILTV LJS09 gB 主要抗原表位区域基因的重组NDV cDNA 克隆，通过将gB基因截短表达，有望改善重组病毒生物学特性，从而提高重组病毒的免疫保护效力。本实验拯救出重组病毒rL-gB1-440，实验证明rL-gB1-440具有遗传稳定性，连续传代gB1-440蛋白可稳定表达，为研制更加有效的预防ND 和ILT 的二价疫苗奠定了基础。

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