一株虎源H5N1亚型禽流感病毒的分离鉴定及生物学特性研究

崔艳芳，王德丽，刘丽娜，赵 璐，刘丽玲，田国彬，曾显营，李雁冰，陈化兰

(中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/国家禽流感参考实验室，黑龙江哈尔滨 150001)

禽流感病毒(Avain influenza virus，AIV)属于正黏病毒科，流感病毒属，为单股负链RNA 病毒[1]。AIV 可依据其表面糖蛋白HA 和NA 的抗原性划分为16 个HA 亚型和9 个NA 亚型[2]，其中H5N1 亚型AIV 备受关注。1959 年在英国的鸡群中暴发禽流感，经鉴定为H5N1 亚型AIV[3]，1996 年在我国广东的鹅群暴发禽流感，经鉴定为H5N1 亚型AIV[4]。由于流感病毒的高度变异性，导致AIV 突破种间屏障，获得了对人的感染性。1997 年发生的香港流感事件(H5N1)、2004 年东南亚H5N1 及2013 年大陆H7N9 亚型AIV 感染人事件[5-7]，AIV 已经成为目前严重危害人类健康的重要传染病之一。我国自2003年起先后从发病虎病料样品中分离出多株H5N1 亚型高致病性禽流感病毒(HPAIV)[8]，提示应该加强对哺乳动物尤其是食肉动物的禽流感病毒监测工作。本研究对广西省南宁市动物园病死白虎组织样品内的病原分离株进行了全基因序列测定及分析，并对其进行哺乳动物模型的感染与致病能力评估，为进一步研究H5N1 亚型AIV 在自然界中的进化规律提供了实验依据。

1 材料和方法

1.1 病毒株、SPF鸡胚及实验动物 H5N1 亚型AIV Tiger/GX/1/15(H5N1)分离自广西南宁市动物园发病白虎组织样品中，由国家禽流感参考实验室鉴定并保存；9 日龄～10 日龄SPF 级鸡胚及6 周龄SPF 鸡购自本研究所实验动物中心；6 周龄雌性SPF级BALB/c 小鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司；鼠致病性试验在本研究所动物生物安全三级实验室(ABSL-3)内进行。

1.2 主要试剂 RNA 提取试剂TRIzol、RNA 酶抑制剂及鼠源反转录酶(M-MLV)购自Invitrogen 公司；r Taq DNA 聚合酶、DNA Marker DL2000 购自TaKaRa公司；胶回收试剂盒购自OMEGA 公司；测序反应试剂盒BigDye Terminator 3.1 购自Applied Biosystems公司。

1.3 病毒纯化与扩增 使用PBS 将病毒原液按10倍倍比稀释，接种10 日龄SPF 鸡胚，每胚0.1 mL，37 ℃培养，48 h 后收集尿囊液。连续纯化3 代，将纯化的病毒冻存于-70 ℃。

1.4 病毒对鸡胚半数感染量(EID50)测定 将纯化增殖后的病毒按10 倍倍比稀释，各稀释度经尿囊腔接种5 枚10 日龄SPF 鸡胚，37 ℃培养48 h 后收集尿囊液测其血凝价，根据Reed-Muench 法[9]计算EID50。

1.5 全基因组序列测定及遗传演化分析 提取病毒的基因组RNA，反转录后对其8 个基因节段进行扩增，利用胶回收剂盒纯化扩增产物，按照测序反应试剂盒说明书进行测序反应。利用软件中的SeqMan 程序进行序列的拼接，利用MEGA5.0 软件进行序列的比对、分析及构建进化树。

1.6 对BALB/c小鼠的致病性试验 根据EID50的数值，将病毒稀释至终浓度为101～106EID50/50 μL。经鼻腔途径接种50 μL 病毒悬液，106EID50组8 只，其余各组5 只，连续观察14 d，每天记录小鼠的体重变化及死亡情况。随机选取106EID50组中的3 只小鼠对小鼠均进行安乐死，无菌采集脑、脾、肾、肺及鼻甲骨，研磨、离心后收集上清，在鸡胚中进行病毒滴定，检测病毒在小鼠各脏器中的复制情况。最后根据每组小鼠的死亡数据用Reed-Muench法[9]计算病毒对小鼠的半数致死量(MLD50)。

2 结果

2.1 病毒的序列测定和特征性位点分析 对Tiger/GX/1/15 的全基因组测序后进行BLAST 分析，结果显示：其PB2、PB1、M 与CK/HuN/1/12(H9N2)有最高的相似性，分别为98.9 %、98.7 %及98.0 %；其他5 个基因节段分别与H5N1 亚型AIV 具有最高相似性(表1)。在HA 蛋白水平上分析显示：该病毒HA 蛋白裂解位点处为341RRRKR345，为典型HPAIV的分子特征。利用NetNGlyc1.0 Server 软件在线分析糖基化位点，结果表明：该病毒HA 蛋白有8 个潜在糖基化位点，分别为：27NST29、39NVT41、170NNT172位、181NNT183、209NTT211位、302NSS304、500NGT502及559NGS561。在NA 蛋白水平上进行分析发现，NA 蛋白有2 个潜在糖基化位点，分别是146NGT148和235NGS237，并且其颈部在49～68 位缺失20 个氨基酸。

2.2 病毒的遗传进化分析 将Tiger/GX/1/15(H5N1)的HA 基因与已知的H5 亚型参考病毒株进行多序列比对，并进行遗传演化分析。结果显示，该分离株属于Clade 2.3.2.1 分支，并且与A/wild duck/Jilin/HF/2011(H5N1)及A/duck/Hunan/S4150/2011(H5N1)处在同一个独立的小分支(图1)。

表1 与Tiger/GX/1/15(H5N1)的8 个节段同源性最高的流感病毒株Table 1 Genetic identity of Tiger/GX/1/15(H5N1)to reference strains

图1 病毒分离株的HA 基因的进化分析Fig.1 Phylogenetic analysis of the isolate based on HA gene sequences

2.3 对小鼠的致病性 小鼠通过鼻腔途径接种106EID50/50 μL 病毒液后，其平均体重呈现逐渐下降趋势(图2)。在接种后的第7 d 死亡一只小鼠，第8 d死亡两只小鼠，至第14 d 剩余一只小鼠。

图2 经鼻腔接种病毒后小鼠的体重变化Fig.2 Weight change of mice post inoculation

2.4 病毒在小鼠的各脏器复制情况 人工感染小鼠的脏器病毒滴定结果显示，病毒接种48 h 后，在小鼠的肺脏中分离到较高滴度的病毒，而在脾、肾和鼻甲骨中分离到较低滴度的病毒，在脑中没有分离到病毒(图3)。

图3 病毒感染后第3 d 脏器中病毒复制情况Fig.3 Virus replication in tissues of mice post inoculation on day 3

3 讨论

本研究对分离到的Tiger/GX/1/15(H5N1)流感病毒株全基因组序列分析表明：该病毒株与CK/HuN/1/12(H9N2)亚型流感病毒株相应基因节段的相似性最高，提示该分离株可能为一株重组病毒。对HA蛋白的受体结合位点分析发现，其各位点均未发生突变，病毒具有典型的与禽类受体结合的特征。NA蛋白在颈部在aa49～aa68 位缺失20 个氨基酸，与近年来H5N1 亚型AIV 优势流行株NA 蛋白茎部20个氨基酸缺失的现象相一致。近年来研究发现，AIV 致病力的高低与NA 基因颈部氨基酸的缺失与否也密切相关[10]。

小鼠是研究AIV 对哺乳动物致病性的良好模型之一。将该病毒对小鼠进行鼻腔接种后连续观察14 d，发现其体重逐渐下降并在接种后的第7 d 死亡1 只小鼠。脏器滴定显示该病毒能够在小鼠体内多个器官复制，除了在脑中没有检测到病毒，在肺、脾、肾及鼻甲中均检测到流感病毒，这与相关文献中的报道保持一致[11]。通过测定该病毒的MLD50，表明该病毒对小鼠具有中等致病性。同时也表明该分离株未经适应便具备感染小鼠并对小鼠具有较高致死的能力。

本研究从病毒对小鼠的致病性入手，探索了H5N1 亚型AIV 对哺乳动物的致病性特征，为进一步阐明H5 亚型AIV 在自然界中的进化及重组机制提供了相关的实验依据。

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