骨愈搽剂中总黄酮及其单体成分的体外透皮行为研究Δ

高 瑛，赵淑慧，陆 洋，温 然（1.北京中医医院顺义医院，北京 101300；.北京中医药大学中药学院，北京 10010）

骨愈搽剂处方来源于北京中医医院顺义医院骨外科治疗骨性关节炎应用多年的临床经验方，由透骨草、鸡血藤、艾叶、红花等6味中药组成，具有祛风除湿、活血通络的功效，将其制成搽剂后可具有使用携带方便、有效成分含量高且可控、患者依从性好等特点，更加适合现代社会广泛应用。该处方中有效成分以总黄酮为主，其含量最高，单体成分以羟基红花黄色素A（HSYA）最明确，故本研究以总黄酮、HSYA 为指标，考察骨愈搽剂的体外透皮情况，并比较两指标成分体外透皮行为的相关性，为骨愈搽剂的研制开发提供数据支持。根据2010年版《中国药典》（一部）[1]及处方药味透骨草、红花、鸡血藤[2-4]等相关文献报道，总黄酮的含量以芦丁为对照品，采用紫外-可见分光光度法测定，HSYA 的含量采用高效液相色谱法进行测定。

1 材料

1.1 仪器

Agilent 1200 高效液相色谱仪（美国Agilent 公司）；TU-1810 紫外-可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）；BS 110S 电子分析天平（北京赛多利斯科学仪器有限公司）；YB-P6 智能透皮试验仪（天津药典标准仪器厂）；KQ5200DA超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。

1.2 药品与试剂

骨愈搽剂[北京中医医院顺义医院自制，批号：20120830，规格：1 g（生药）/ml]；芦丁对照品（批号：100080-200707，纯度：90.5%，供紫外含量测定用）、HSYA 对照品（批号：111637-201106，纯度：98%）均购自中国食品药品检定研究院；甲醇、乙腈、磷酸为色谱纯，乙醇等其他试剂均为分析纯。

1.3 动物

2 方法与结果

2.1 小鼠皮肤的处理[5]

将小鼠断颈处死，取适量脱毛膏均匀涂于小鼠腹部脱去鼠毛，取下腹皮，用干棉花将脂肪及黏液组织擦试干净，用清水和生理盐水反复冲洗后，包于铝箔纸内，于冰箱冷冻保存备用。实验前自然解冻，目测皮肤完整性，不得有任何破损。

2.2 总黄酮的含量测定

2.2.1 测定方法 将体外透皮试验取出的4 ml接收液置于10 ml量瓶中，以NaNO2-Al（NO3）3为显色剂显色，即加入50 mg/ml NaNO2溶液0.4 ml，摇匀后静置6 min；再加入100 mg/ml Al（NO3）3溶液0.4 ml，摇匀后静置6 min；加 入100 mg/ml NaOH 溶液4.0 ml，再加50%乙醇定容至刻度，摇匀后再静置15 min。以无接收液的阴性试剂为空白，采用紫外-可见分光光度法在511 nm波长处测定吸光度，计算接收液中总黄酮含量。

2.2.2 标准曲线的制备 精密量取芦丁对照品溶液（0.16 mg/ml）0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 ml，分别置于10 ml 量瓶中，加50%乙醇至4.0 ml，按“2.2.1”项下方法显色，以无芦丁对照品溶液的阴性试剂为空白，分别在511 nm 波长处测定吸光度。以质量浓度（c）为横坐标、吸光度（A）为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程为A＝10.552c－0.003 7（r＝0.999 7），芦丁的线性范围为0.008～0.064 mg/ml。

2.2.3 回收率试验 取空白接收液，加入0.008、0.032、0.064 mg/ml 的芦丁对照品溶液制备成样品溶液，紫外-可见分光光度法测定总黄酮含量，每组平行操作3 份。结果，低、中、高质量浓度样品溶液的回收率分别为（101.74±1.25）%、（97.60±0.76）%、（99.11±0.59）%，RSD 分别为1.23%、0.78%、0.60%（n＝3）。

2.2.4 精密度试验 按“2.2.3”项下方法制备低、中、高质量浓度的样品溶液，紫外-可见分光光度法测定，每组重复测定5次。结果，峰面积的RSD 分别为3.13%、1.22%、0.97%（n＝5），表明仪器精密度良好。

2.3 HSYA的含量测定[6]

2.3.1 色谱条件[7]色谱柱：DiamonsilTM-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：甲醇-乙腈-0.7%磷酸（26 ∶2 ∶72，V/V/V），流速：1 ml/min；检测波长：403 nm；柱温：30 ℃；进样量：20 μl。

2.3.2 供试品溶液的制备 将接收液用0.45 μm 微孔滤膜滤过，取续滤液即得供试品溶液。

2.3.3 标准曲线的制备 精密称取HSYA 对照品3.03 mg，置于10 ml量瓶中，加25%甲醇稀释至刻度，摇匀，即得母液。分别精密移取适量母液，加25%甲醇制成质量浓度为0.015 15、0.030 3、0.090 9、0.151 5、0.303 0、0.757 5、1.212 0 mg/L 的对照品溶液，进样测定，记录色谱。以质量浓度（c）为横坐标、峰面积（A）为纵坐标，进行回归分析，得回归方程为A＝58.120c+0.015 9（r＝0.999 9），HSYA 线性范围为0.015 15～1.212 0 mg/L。

2.4 体外透皮试验

采用垂直式Franz 扩散池法[8]，使用YB-P6 智能透皮试验仪，上室为扩散室，下室为接收室，扩散室容积为23 ml，有效扩散面积为3.14 cm2，恒温水浴加热，温度37 ℃。试验时，接收室加满释放介质（20%乙醇-生理盐水），将小鼠鼠皮附在接收室上，将其固定在两室之间，再将药液加于鼠皮上，排除气泡。磁搅拌转速设定为400 r/min，在设定的时间点l、2、4、6、8、12 h精密移取5 ml接收液，同时补加等量等温的新鲜接收液。取4 ml 接收液按“2.2.1”项下方法测定接收液中总黄酮含量；其余接收液用0.45 μm微孔滤膜过滤得到样品，按“2.3.1”项下方法测定HSYA含量。

根据公式计算不同取样点总黄酮和HSYA 的单位面积累积渗透量：Q＝/A，式中Q为累积渗透量，A为有效经皮吸收面积，V为接收液体积，Vi为取样体积，cn为第n次取样测得的接收液中药物的质量浓度；ci为第i（i≤n－1）个取样点测得的接收液中药物的质量浓度；为取样时带走的药物累积和。渗透吸收百分率＝（Q×A）/W×100%，其中W为给药量。以药物的Q对取样时间t进行线性回归分析，所得斜率即为透过速率。骨愈搽剂中总黄酮和HSYA 的透皮吸收曲线图见图1，12 h内的渗透吸收百分率见表1、表2，平均单位面积累积渗透量-时间模型拟合方程见表3、表4。

图1 骨愈搽剂中总黄酮和HSYA的渗透吸收曲线图（n＝5）Fig 1 Transdermal absorption curve of total flavonoids and HSYA in Guyu liniment（n＝5）

表1 12 h内总黄酮的渗透吸收百分率Tab 1 Transdermal absorption percentage of total flavonoids within 12 h

表2 12 h内HSYA的渗透吸收百分率Tab 2 Transdermal absorption percentage of HSYA within 12 h

表3 总黄酮平均单位面积累积渗透量-时间模型拟合方程Tab 3 Model fitting equation of average accumulative permeation quantity of total flavonoids per unit areatime

表4 HSYA平均单位面积累积渗透量-时间模型拟合方程Tab 4 Model fitting equation of average accumulative permeation quantity of HSYA per unit area-time

由表3 和表4 可知，骨愈搽剂中总黄酮和HSYA 的透皮吸收过程均符合Higuchi 方程，透过速率分别为126.24、47.516 μg/（cm2·h）。

3 讨论

黄酮类化合物是一类具有C6-C3-C6结构的低分子质量化合物[9]，具有抗炎、抗氧化、抗衰老、抗肿瘤、抗病毒、镇痛、镇静等多方面药理活性，为骨科常用中草药的活性成分。黄酮类化合物对骨关节炎的治疗作用已有广泛研究，其可抑制滑膜组织的异常增殖、抑制关节软骨病变、保护成骨细胞缺氧损伤、激活成骨细胞而促进骨形成等[10-14]。因此，开发黄酮类化合物治疗骨科疾病的相关制剂具有重要意义。

骨愈搽剂属于经皮给药系统制剂，黄酮类化学成分主要通过释放到达皮肤表面，进而经过表皮进入血液循环发挥作用，药物成分的透皮吸收速率会直接影响到临床疗效[15]。因此，药物的渗透吸收百分率是评价经皮给药制剂的重要指标。

本试验研究发现，骨愈搽剂中总黄酮的透皮数据拟合符合Higuchi 方程，12 h 内渗透吸收百分率为8.23%，透过速率为126.24 μg/（cm2·h）；HSYA 的透皮数据拟合亦符合Higuchi方程，12 h 内渗透吸收百分率为28.12%，透过速率为47.516 μg/（cm2·h）。这说明骨愈搽剂中总黄酮和HSYA 的累积渗透量Q均随时间t的增加而增加，并与t1/2有显著相关性；总黄酮的透皮行为与单体黄酮HSYA的透皮行为具有相似性，均可用Higuchi 方程描述其透皮过程，属于骨架扩散型透皮给药系统，具有长效缓释的特点。然而，是否能用Higuchi 方程继续描述骨愈搽剂处方中的其他单体黄酮成分以及Higuchi 方程是否为黄酮类化合物透皮吸收过程的通用方程，则需要更进一步的研究。

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