一株H10N7亚型禽流感病毒的分离鉴定及生物学特性研究

王德丽，慈彦鹏，崔艳芳，樊兆斌，刘丽玲，田国彬，曾显营，陈化兰，李雁冰

(中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 兽医生物技术国家重点实验室/农业部动物流感重点开放实验室，黑龙江 哈尔滨 150001)

禽流感病毒(Avian influenza virus，AIV)属于正黏病毒科流感病毒属，是一种人兽共患病原。根据其表面糖蛋白血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)的不同，可以将AIV 分为不同的亚型，目前已知HA 有16 个亚型，NA 有9 个亚型[1]。2013 年12 月，我国第一次发生H10N8 亚型AIV 感染人并致人死亡的病例，并引起公众对H10 亚型流感病毒的广泛关注[2]。H10 亚型AIV 属于低致病性流感病毒，从家禽体内分离较少，主要感染野生水禽。但近年来，其宿主范围逐渐扩大，不仅可以感染鸟类，还可以感染猪[3]。曾有报道H10 其他亚型AIV 感染水貂，并导致水貂大量死亡[4]。在H10 亚型流感病毒中，NA 基因涵盖了9 个亚型，其中H10N7 亚型流感病毒占的比例最高，达到61.11 %[5]。本研究选取2013 年从秦皇岛林鹬体内分离到的一株H10N7 亚型AIV 进行全基因组序列测定及分析，并对其生物学特性进行研究，为进一步研究H10 亚型AIV 在自然界中的进化规律提供实验依据。

1 材料和方法

1.1 病毒株、SPF鸡胚及实验动物 WSP/QHD/660-662/2013(H10N7)分离自河北省秦皇岛市野鸟林鹬体内，由国家禽流感参考实验室分离鉴定；9～10 日龄SPF 鸡胚购自本研究所实验动物中心；6 周龄SPF 级雌性BALB/c 小鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司。

1.2 主要试剂 RNA 提取试剂TRIzol、RNA 酶抑制剂以及鼠源反转录酶(M-MLV)购自Invitrogen 公司；r Taq DNA 聚合酶、dNTP 及DL2000 DNA Marker均购自TaKaRa 公司；胶回收试剂盒购自OMEGA公司；测序反应试剂盒BigDye Terminator 3.1 购自Applied Biosystem 公司。

1.3 病毒纯化与扩增 采用PBS 将病毒原液按10倍倍比稀释，接种10 日龄SPF 鸡胚，每胚0.1 mL。37 ℃培养，72 h 后收集尿囊液，连续纯化3 代。将纯化后病毒无菌分装，冻存于-70 ℃冰箱。

1.4 全基因组序列测定及遗传演化分析 提取病毒全基因组RNA，反转录后扩增8 个基因节段，利用胶回收试剂盒回收PCR 产物。按照BigDye Terminator 3.1 测序反应试剂盒进行测序。利用DNAStar软件进行序列拼接，利用MEGA5.0 进行序列比对、分析并构建进化树。

1.5 病毒对BALB/c小鼠的致病性试验 将含病毒分离株的尿囊液倍比稀释为106EID50/50 μL，经鼻腔感染8 只6 周龄BALB/c 小鼠。人工感染后72 h，将3 只小鼠施以安乐死，无菌采集0.1 g 鼻甲骨、脑、肺、脾及肾，于1 mL 含双抗的PBS 溶液中。研磨、离心，取上清液按10～105倍比稀释，接种10 日龄SPF 鸡胚，检测病毒在小鼠各脏器的复制情况。连续14 d 观察其余5 只小鼠状态，并每日称重。

2 结果

2.1 病毒全基因组序列测定及分析 将WSP/QHD/660-662/2013(H10N7)分离株的全基因组序列测定后，与GenBank 登录的AIV 序列经Blast 比较，结果显示：该分离株HA 基因与A/Duck/Hunan/S11205/2012(H10N3)相似性最高，达到97.9 %，而NA 基因与 A/Domestic Duck/Republic of Georgia/1/2010(H10N7)相似性最高，达到97.46 %。6 个内部基因与H9N2、H7N9 等病毒株具有较高的相似性(表1)。在HA 蛋白水平上，该分离株HA 蛋白裂解位点为334PELMQGRGL343，为典型低致病性AIV 的分子特征。利用NetNGlyc1.0 Server 软件在线分析糖基化位点，结果表明：该流感病毒分离株HA 蛋白具有6 个潜在的糖基化位点，分别为：29NGT31、45NAT47、252NIT254、306NLS308、422NWT424以 及494NNT496。受体结合位点186S、226Q 以及228G 具有典型的与禽类受体结合的特征。NA 蛋白有9 个潜在的糖基化位点，分别为位于32NVS34、47NLT49、56NNT58、67NNT69、87NKS89、145NGT147、200NAT202、234NGT236以 及401NWS403，而 且NA 蛋白的颈部无氨基酸的缺失。

表1 与WSP/QHD/660-662/2013(H10N7)的8 个节段同源性最高的流感病毒株Table 1 Genetic identity of WSP/QHD/660-662/2013(H10N7)to reference strains

2.2 遗传演化分析 将WSP/QHD/660-662/2013(H10N7)的HA 基因与已知的H10 亚型参考病毒株进行多序列比对，并进行遗传演化分析(图1)，结果显示该分离株HA 属于欧亚谱系，并且与人体内分离到的A/Jiangxi-Donghu/346/2013(H10N8)[6]处于同一个独立的小分支，与从猪体内分离到的A/swine/Hubei/10/2008(H10N5)进化关系较远。

2.3 对小鼠的致病性试验

2.3.1 人工感染小鼠的体重变化 小鼠经人工感染后，感染组与空白对照组小鼠均未死亡，未表现出任何临床症状，并且不影响体重正常增长(图2)。

图1 基于WSP/QHD/660-662/2013(H10N7)HA 基因的系统进化树Fig.1 Phylogenetic tree based on the sequence of the HA gene of WSP/QHD/660-662/2013(H10N7)

2.3.2 病毒在小鼠体内复制情况 人工感染小鼠72 h后，在小鼠的肺和鼻甲骨中分离到较低滴度的病毒，分别为1.13 log10EID50和3 log10EID50。其他脏器(脑、脾和肾)均未分离到病毒(表2)。

3 讨论

本研究对分离到的H10 亚型AIV WSP/QHD/660-662/2013(H10N7)株进行全基因组序列分析表明：该分离株与多种亚型流感病毒株相应基因节段的相似性最高，提示该分离株可能为一株重组病毒。该分离株HA 蛋白裂解位点不存在多个连续的碱性氨基酸，并且受体结合位点具有典型的与禽类受体结合的特征。

图2 感染后小鼠的体重变化Fig.2 Weight change of mice post inoculation

表2 感染后第3 d 脏器病毒复制Table 2 Virus replication in tissues of mice post inoculation on day 3(Log10EID50)

人工感染小鼠后，未发现其体重下降和死亡，也无明显的发病症状，仅在小鼠的肺和鼻甲骨中检测到少量的病毒复制。表明该分离株对小鼠呈现低致病性，并且没有获得对哺乳动物的适应性。其致病性试验结果与该分离株的HA 蛋白裂解位点只有一个碱性氨基酸的低致病性AIV 的特征相吻合。但有文献报道，某些H10 亚型流感病毒即使在HA 蛋白裂解位点不存在多个连续的碱性氨基酸，对鸡或者水貂也呈现高致病性[4,7]。所以，HA 蛋白裂解位点处的碱性氨基酸个数不是评价H10 亚型流感病毒致病性的唯一因素[8]。某些H10 亚型AIV NS1 蛋白单个氨基酸的突变会导致病毒逃避宿主免疫应答，对水貂的致病性增强[9]。

H10 亚型AIV 自2013 年致人死亡病例发生之后才逐渐引起公众的重视，目前对H10 亚型AIV 的研究鲜有报道。本研究利用从野鸟体内分离的一株H10N7 亚型AIV 进行遗传演化分析以及小鼠的致病性试验，为进一步研究H10 亚型AIV 的遗传进化以及对哺乳动物的致病性提供了一定的实验依据。

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