侧柏叶炮制前后成分的对比

谭晓亮，李瑞海，贾天柱



侧柏叶炮制前后成分的对比

谭晓亮1，李瑞海2*，贾天柱2

目的 建立HPLC法测定侧柏叶及其炮制品中杨梅苷、槲皮苷、杨梅素、槲皮素、山柰酚、穗花杉双黄酮及扁柏双黄酮的含量，对比侧柏叶炮制前后7种成分的含量变化。方法 采用药典法进行炮制。色谱柱为Welch Ultimate LP-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流动相为甲醇-0.2%磷酸水梯度洗脱，检测波长为330 nm，流速1 mL/min。结果 杨梅苷、槲皮苷、杨梅素、槲皮素、山柰酚、穗花杉双黄酮及扁柏双黄酮的标准曲线呈良好的线性关系(r≥0.999 5)，各组分平均回收率在97.6%～101.1%之间，RSD≤1.14%(n=6)。炮制后，杨梅苷、槲皮苷、穗花杉双黄酮及扁柏双黄酮含量降低，而杨梅素、槲皮素及山柰酚含量相对升高。结论 所建立的HPLC法简便易行，可用于侧柏叶、侧柏炭的含量测定。侧柏叶炮制前后成分种类和量的改变，表明其炮制过程存在着成分转化过程。

侧柏叶；侧柏炭；HPLC；杨梅苷；槲皮苷；杨梅素；槲皮素；山柰酚；穗花杉双黄酮；扁柏双黄酮

0 引言

侧柏叶为柏科植物侧柏Platycladus orientalis(L.)Franco的干燥枝梢和叶，具有凉血止血、化痰止咳、生发乌发的作用。用于吐血、衄血、咯血、便血、崩漏下血、肺热咳嗽、血热脱发、须发早白[1]。侧柏叶作为治疗出血症之要药，其炮制方法历代本草记载有生用或炒用、烧灰存性等，现代生制并用。侧柏叶生品多用于血热妄行的吐血衄血，咳喘及脱发；侧柏叶炭则偏于收涩止血，多用于各种出血症。2010年版《中国药典》仅对生品中槲皮苷进行含量测定。近代炮制研究报道，侧柏叶制炭后槲皮苷部分分解生成槲皮素[2]。本实验以杨梅苷、槲皮苷、杨梅素、槲皮素、山柰酚、穗花杉双黄酮和扁柏双黄酮为指标，对侧柏叶、侧柏炭的含量进行测定，对比炮制前后成分的变化，为进一步的侧柏叶炮制机理的相关研究奠定基础[3-5]。

1 实验仪器与材料

P230II UV230II紫外检测器，EC2006-色谱数据处理工作站(大连依利特)；KQ3200超声波清洗器(江苏昆山)，十万分之一电子天平(德国赛多利斯)。槲皮苷(批号:111538-200504)、槲皮素(批号:10081-00901)(中国药品生物制品检定所)、杨梅苷(批号:20130528)、杨梅素(批号:20130619)、山柰酚(批号:20130623)、穗花杉双黄酮(批号:20130713)、扁柏双黄酮(批号:20140112)(大连美仑生物技术有限公司，纯度>99%)；水为重蒸馏水，甲醇为色谱纯；其他试剂为分析纯。不同产地侧柏叶、侧柏炭药材经辽宁中医药大学尹海波教授鉴定均为柏科植物侧柏Platycladus orientalis(L.)Franco的干燥枝梢和叶，具体来源见表1。

表1 侧柏叶来源

2 方法与结果

2.1 含量测定

2.1.1 对照品溶液的制备 精密称定对照品适量，加甲醇制成杨梅苷0.032 mg/mL、槲皮苷0.051 mg/mL、杨梅素0.006 1 mg/mL、槲皮素0.008 2 mg/mL、山柰酚0.007 1 mg/mL、穗花杉双黄酮0.065 mg/mL、扁柏双黄酮0.047 mg/mL的混合对照品溶液，即得。

2.1.2 供试品溶液的制备 取样品粉末约0.2 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50 mL，密塞，称定重量，超声处理30 min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.2 色谱条件 色谱柱为Welch Ultimate LP-C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相按表2进行设定；检测波长为330 nm；流速为1 mL/min；柱温35 ℃；进样量为20 μL。

表2 流动相梯度表

2.3 专属性实验 精密吸取对照品溶液、供试品溶液各20 μL，在上述选定的色谱条件下进行测定，结果7种对照品的分离度良好，且与供试品中的其他成分不干扰。色谱图见图1。

图1 侧柏叶和侧柏炭的HPLC图

2.4 标准曲线的绘制 分别精密吸取7种混合对照品溶液各1.0、3.0、5.0、7.0、9.0 mL，分别以甲醇溶解并定容于10 mL量瓶中，按“2.2”项下的色谱条件，注入液相色谱仪器中，测定色谱峰面积，以对照品进样量X(μg)为横坐标、峰面积值为纵坐标Y，绘制标准曲线，回归方程与线性范围见表3。

2.5 精密度试验 精密吸取混合对照品20 μL，连续进样6次，测定峰面积，结果7种对照品的峰面积RSD值见表4，说明本实验精密度良好。

2.6 重复性试验 取同一样品6份，按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，并按“2.2”项下色谱条件进行HPLC测定，结果7种对照品的峰面积RSD值见表4，说明方法重现性良好。

表3 7个黄酮类化合物的回归方程

2.7 稳定性试验 取同一供试品溶液，按“2.2”项下色谱条件，于0、2、4、8、12、24 h进样测定，结果7种对照品的峰面积RSD值见表4，表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.8 加样回收试验 取已知含量的样品粉末6份，每份0.2 g，精密称定，置于50 mL具塞锥形瓶中，精密加入对照品溶液杨梅苷0.032 mg/mL、槲皮苷0.051 mg/mL、杨梅素0.006 1 mg/mL、槲皮素0.008 2 mg/mL、山柰酚0.007 1 mg/mL、穗花杉双黄酮0.065 mg/mL、扁柏双黄酮0.047 mg/mL各1 mL，按“2.1.2”项下进行制备，按“2.2”项下色谱条件进行HPLC测定，计算回收率，结果见表4。

表4 方法学考察试验结果

2.9 侧柏叶炮制品制备及样品测定结果

2.9.1 侧柏炭 取净侧柏叶，照炒炭法[1](附录ⅡD)炒至表面黑褐色，内部焦黄色。本品形如侧柏叶，表面黑褐色。质脆，易折断，断面焦黄色。气香，味微苦涩。

2.9.2 侧柏叶炒黄炒焦 取净侧柏叶，照炒法[1](附录ⅡD)，其中炒黄品，取净侧柏叶，用文火炒至表面颜色加深，有香味。炒焦品，取净侧柏叶，用文火炒至表面有焦斑，起锅放凉。

2.9.3 侧柏叶及炮制品中7种对照品含量 取样品，按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，分别吸取各供试品溶液20 μL，按“2.2”项下色谱条件测定，记录各供试品7种的对照品的色谱图，采用外标一点法，依据标准曲线的回归方程进行含量计算，结果见表5。

表5 侧柏叶、侧柏炭中7种对照品的含量(mg/g)

3 讨论

3.1 预实验显示，在330 nm处所示色谱峰数目较多，分离较好，基线较平稳，因此选用330 nm为检测波长。本实验所建立的方法简便易行，精密度、回收率、重现性均符合要求。由于目前普遍认为中药是以多组分协同而起效，因此，本研究所建立的多个指标的含量测定方法，为制定侧柏叶质量控制方法提供了依据[6]。

3.2 本实验结果表明，侧柏叶中检出杨梅苷、槲皮苷、杨梅素、穗花杉双黄酮及扁柏双黄酮成分，但检不出槲皮素、山柰酚成分，侧柏叶经过炮制后，炒焦、炒炭品中均可检出7种成分，特别是在侧柏炭中变化最为明显，其杨梅苷、槲皮苷、穗花杉双黄酮和扁柏双黄酮成分含量均下降，穗花杉双黄酮和扁柏双黄酮成分含量下降显著，而杨梅素、槲皮素、山柰酚成分含量上升显著，提示侧柏叶在炮制过程中出现了成分转化的过程，其机制有待于进一步的研究[7]。

3.3 目前侧柏叶的成分研究多见于生品或者炮制品单独研究等，本实验把生品和炮制品结合起来同时测定相关成分，对于侧柏叶炮制过程的机

理研究，有非常重要的作用。同时，目前文献报道的侧柏叶指标性成分，以杨梅苷、槲皮苷等5种成分为多，本实验条件确定了侧柏叶中还含有穗花杉双黄酮、扁柏双黄酮成分，建立同时测定7种成分的HPLC条件，并对比了炮制前后成分的变化，为侧柏叶炮制机理的进一步研究奠定了基础[8-10]。

[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典(一部)[S].北京:中国医药科技出版社,2010.

[2] 孙立立,杨书斌,江波,等.炮制对侧柏叶化学成分的影响[J].中成药,2006,28(6):821.

[3] 于祝婷,单鸣秋.侧柏叶不同物候期槲皮苷含量动态积累研究[J].中国现代中药,2011,13(2):35-36.

[4] 吴怀恩,甄汉深,韦志英,等.RP-HPLC法同时测定侧柏叶炭中槲皮素和山柰素的含量[J].中国药房,2009,20(12):934.

[5] 黄樱华,黄月纯,魏刚,等.正交试验法筛选侧柏叶总黄酮的提取工艺[J].中国实验方剂学杂志,2009,15(11):34-37.

[6] 单鸣秋,高静,丁安伟.超高效液相色谱法测定侧柏炭中5个黄酮类成分[J].中草药,2011,42(2):282-284.

[7] 徐军,李瑞海.用HPLC法测定心通片中葛根素的含量[J].实用药物与临床,2008,11(2):120-121.

[8] 李宇馨,李瑞海.小檗碱抗炎活性研究[J].实用药物与临床,2013,16(1):43-44.

[9] 孟晓岩.高效液相色谱法同时对金银花中5种有效成分的含量测定[J].实用药物与临床,2012,15(2):93-95.

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Comparison of components before and after processing ofCacumenPlatycladi

TAN Xiao-liang1,LI Rui-hai2*,JIA Tian-zhu2

(1.Shenyang Traditional Chinese Medicine,Shenyang 100020,China;2.China College of Pharmacy,Liaoning University of Traditional Chinese Medicine,Dalian 116600,China)

Objective To establish an HPLC method with myricetrin,quercitrin,myricetin,quercetin,kaempferol,amentoflavone and hinokiflavone as reference subatances inCacumenPlatycladiand processedCacumenPlatycladi,and compare the components before and after processing ofCacumenPlatycladi.Methods Pharmacopoeia method was used in processing.The chromatographic column was Welch Ultimate LP-C18(4.6 mm×250 mm，5μm),gradient mobile phase were methanol-0.2% phosphoric acid,the detection wavelength was 330 nm,flow rate was 1 mL/min.Results The linear relationship of myricetrin,quercitrin,myricetin,quercetin,kaempferol,amentoflavone and hinokiflavone had good linearity (r≥0.999 5).The average recovery rate was 97.6%～101.1%,withRSD≤1.14% (n=6).The content of myricetrin,quercitrin,amentoflavone and hinokiflavone inCacumenPlatycladiwas declined after processing,and the content of the quercetinand and kaempferol increased.Conclusion The method can be used for determination of the content of theCacumenPlatycladiand processedCacumenPlatycladi.The results of the content shows that the flavone inCacumenPlatycladichanged by processing.

CacumenPlatycladi;Cacumen Platycladi Carbonisatum;HPLC;Myricetrin;Quercitrin;Myricetin;Quercetin;Kaempferol;Amentoflavone;Hinokiflavone

2015-03-04

1.沈阳市中医院，沈阳 100020；2.辽宁中医药大学药学院，大连 116600

*通信作者

10.14053/j.cnki.ppcr.201511023