丹参酮ⅡA 对大鼠心肌缺血再灌注后HMGB1的影响

胡惠林　钱　钢　唐关敏　周斌全(浙江大学附属邵逸夫医院心内科，浙江　杭州　3006)

丹参酮ⅡA 对大鼠心肌缺血再灌注后HMGB1的影响

胡惠林1钱钢1唐关敏1周斌全
(浙江大学附属邵逸夫医院心内科，浙江杭州310016)

〔摘要〕目的探讨丹参酮ⅡA(TSA)对大鼠心肌缺血再灌注后的保护作用及其机制。方法建立大鼠假手术组(SHAM组)，缺血再灌注模型(IR组)，低、中、高剂量TSA预处理组(L、M、H-TSA组)。苏木素-伊红(HE)法检测心肌细胞病理变化、酶联免疫吸附(ELISA)法检测血浆高迁移率族蛋白1(HMGB1)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)的表达，RT-PCR、Western印迹检测心肌HMGB1等的表达。结果较IR组相比，HE检测TSA预处理后心肌病理变化减轻，血浆HMGB1等的表达减少，心肌HMGB1、TNF-α的表达减少，并且呈剂量依赖性。结论TSA预处理可以减轻大鼠心肌缺血再灌注损伤，其机制可能与减轻晚期炎症因子HMGB1的表达有关。

〔关键词〕心肌缺血再灌注损伤;丹参酮IIA;高迁移率族蛋白1

1嘉兴市第一医院心内科

第一作者:胡惠林(1979-)，男，副主任医师，在职硕士，主要从事心肌缺血再灌注研究。

心肌缺血再灌注(IR)损伤〔1〕是指心肌缺血在重新恢复血流供应后反而会造成心肌功能、超微结构、电生理方面及代谢的进一步损伤。丹参酮ⅡA(TSA)是从丹参中提取的一种具有抗缺氧的脂溶性成分，可以改善血液流变学特性、舒张冠状动脉、减轻心肌缺血、改善微循环等多种药理作用〔2〕。本实验进一步探讨TSA对心肌IR损伤的保护机制，研究其对晚期炎症因子高迁移率族蛋白1(HMGB1)的影响。

1　材料与方法

1.1实验材料Wistar雌性大鼠50只，5～8月龄，体重260～300 g，由浙江大学实验动物中心提供，合格证号: SCXK(浙) 2013-0023;大鼠HMGB1、肿瘤坏死因子(TNF) -α酶联免疫吸附(ELISA)试剂盒(武汉博士德生物科技有限公司) ; HMGB1、TNF-α兔多克隆抗体(英国Abcam公司) ; RNA试剂提取盒和RT-PCR试剂盒购于大连宝生物工程有限公司。丹参酮IIA购于雅安三九药业有限公司提供，批号881010。

1.2大鼠IR模型建立和分组心肌IR大鼠模型建立:使用8％的水合氯醛腹腔内注射(5 ml/kg)麻醉，连接动物呼吸机，心电监护监测平均心率和动脉压。用线穿过冠状动脉左室支左心耳下缘处，通过硅胶管结扎，阻断冠状血流约20 min，然后放松结扎线再灌约1 h，完成IR损伤模型。心电图肢导联的变化来判断模型质量，以ST段抬高＞0.5 mV为心肌缺血，松开后，增高的R波振幅降低、伴有Q波出现或心律失常、抬高的ST段下降1/2以上判断为再灌注损伤形成，实验终点检测各项指标。实验分组: 50只大鼠随机分为五组，假手术组(SHAM 组)，心肌I/R模型(IR组)，低、中、高剂量TSA预处理组(L、M、H-TSA组)，每组10只，其中TSA预处理组(L、M、H-TSA) TSA给药方式为缺血再灌注前1 w腹腔注射TSA溶液，剂量分别为10、20、40 mg/kg。

1.3苏木素-伊红(HE)染色法检测心肌病理变化取实验各组大鼠心脏，剪去右心室、心房及血管，保留室间隔心肌及左心室，心肌组织经4％甲醛固定后，石蜡包埋，切片供HE染色，光镜下观察大鼠心肌结构变化。

1.4ELISA检测各组血浆HMGB1、TNF-α的表达试验终点时间，暴露下腔静脉，抽静脉血进行离心，根据实验说明进行操作。450 nm波长下用酶联仪依序测量各组光密度(OD值)。以标准物的浓度为横坐标(对数坐标)，OD值为纵坐标(普通坐标)，绘制标准曲线，计算出实验各组的实际浓度。

1.5RT-PCR法检测各组心肌HMGB1、白细胞介素(IL) -6、TNF-α mRNA的表达按试剂盒的说明书操作，以逆转录cDNA为模板，内参照为甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)，采用Rotor gene3000荧光定量分析仪进行实时定量PCR反应，检测实验大鼠HMGB1、MCP-1、TNF-α mRNA的表达。TNF-α正义引物5'CCCCTTTATCGTCTACTCCTC-3'，反义: 5'GCTGGTAGTTTAGCTCCGTTT-3'，长度533 bp; IL-6正义: 5'GGATACCACCCACAACAGAC-3'，反义: 5' TTGCCGAGTAGACCTCATAG-3'，长度520 bp; HMGB1正义: 5'GCATCCCAAGTACGAGTGGT-3'，反义: 5'GAAGGCGTAG CTGAACAAGG-3'，长度700 bp; GAPDH，正义: 5' CCATCACTGCCACTCAGAAGA-3'，反义: 5' CATGAGGTCCACCACCCTGT-3'，长度446 bp。

1.6Western印迹检测各组心肌HMGB1蛋白的表达随机选取5只大鼠，处死迅速取心肌。参照说明书操作，以GAPDH蛋白作为内参。使用LabWork 4.0图像分析软件进行分析。

1.7统计学方法应用SPSS11.5软件进行正态性及方差齐性检验、ANOVA分析、Dunnett-t检验和χ2检验。

2　结果

2.1HE染色法检测心肌病理变化SHAM组大鼠心肌组织排列整齐，染色均匀，呈束状，纤维完整，结构清晰，细胞膜及细胞核完整，病理积分5.02±0.78。IR组大鼠心肌组织间质水肿，可见大量炎症细胞浸润，心肌细胞可见大片状坏死，心肌纤维部分有断裂，边界欠清，细胞出现破裂、浓缩、溶解现象，病理积分20.50±3.22，明显高于SHAM组(P＜0.05)。而TSA组心肌纤维染色不均，间质水肿，排列紊乱，部分细胞核有消失、浓缩现象，但与IR组相比明显减轻，而且结果提示TSA剂量越大，心肌病理损伤越轻，L、M、H-TSA组病理积分分别为18.23± 2.86、15.56±2.47、8.15±1.88，明显高于SHAM组，低于IR组(均P＜0.05)。见图1。

图1　实验各组心肌病理变化

2.2ELISA检测各组血浆HMGB1、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)表达I/R后血浆HMGB1、MDA表达均明显升高，SOD表达下降(P＜0.05) ; TSA组血浆HMGB1、DMA明显低于IR组(P＜0.05)，SOD表达高于IR组，且剂量越高，损伤作用越轻。见表1。

2.3RT-PCR法检测各组心肌HMGB1、IL-6、TNF-α mRNA的表达IR组后炎症因子HMGB1、IL-6、TNF-α蛋白水平明显升高(P＜0.05)，而TSA组炎症因子HMGB1、IL-6、TNF-α蛋白水平要低于IR组(P＜0.05)。见图2。

表1　ELISA法检测实验各组SOD、MDA、HMGB1的表达(±s，n=10)

表1　ELISA法检测实验各组SOD、MDA、HMGB1的表达(±s，n=10)

与SHAM组比较: 1) P＜0.05;与IR组比较: 2) P＜0.05;下图同

组别　SOD(U/ml)　 MDA(nmol/ml)　 HMGB1(ng/ml) SHAM组　251.53±31.38　 3.72±0.95　 2.91±0.32 IR组　152.68±14.381)　6.18±0.681)　9.25±2.811)L-TSA组　181.14±21.251) 2)5.63±0.871) 2)　8.83±2.271) 2)M-TSA组　197.62±31.491) 2)4.64±0.741) 2)　6.57±1.981) 2)H-TSA组　224.58±24.561) 2)4.37±0.621) 2)　5.45±1.691) 2)

图2　RT-PCR法检测实验各组炎症指标的表达

2.4Western印迹检测各组心肌HMGB1蛋白的表达IR组后炎症因子HMGB1蛋白水平明显升高(P＜0.05)，而TSA组炎症因子HMGB1白水平要低于IR组(P＜0.05)，呈剂量依赖性。与GAPDH相比，SHAM组、IR组、L-TSA组、M-TSA组、H-TSA 组HMGB1相对含量分别为0.45±0.07，0.92±0.18，0.75± 0.10，0.62±0.08，0.55±0.04。见图3。

图3　Western印迹检测实验各组HMGB1的表达

3　讨论

缺血心肌恢复血流后组织功能代谢障碍，结构进一步破坏，甚至发生不可逆性的损伤〔3〕，称为心肌IR损伤，它引起的心功能障碍程度比急性心肌梗死更严重，死亡率更高，特别集中再老年人群。因此如何减轻心肌IR损伤，成为目前基础和中医药学研究的热点。中医一般采用辨证分型治疗心肌缺血，分为心血瘀阻型、痰浊壅盛型、心阴两虚型、心肾阳虚型。

TSA是从中药丹参中提取的一种脂溶性物质，具有副作用小、作用广泛等优点。以往的研究显示，TSA可以抑制醛固酮的合成，预防高血压性心脏病所致左室肥厚〔4〕，还可以减轻早期炎症反应ICAM-1和P-选择素的表达，减轻IR损伤炎症反应〔5〕。陈清华等〔6〕报道TSA可以改善心血瘀阻证时心肌细胞染色以及心电图改变;郭张强等〔7〕报道，TSA可以保护急性心肌梗死后无复流患者的内皮祖细胞，在无复流中具有重要的免疫调节功能。另有实验表明，TSA对大鼠缺糖缺氧性脑损伤均具有保护作用〔3〕。以上研究显示丹参酮ⅡA对大鼠心肌IR损伤具有保护作用，但是其心肌保护作用的具体分子机制仍未被阐明，其是否与调控HMGB1有关仍未见报道。

HMGB1作为一种晚期炎性细胞因子，是致炎细胞因子调控网络中的一个重要中心环节，不仅能促进炎症因子TNF-α、IL-1等表达，还能激活JNK激酶、ERK激酶、P38MAPK激酶，促使核转录因子(NF) -κB核移位〔8〕。Hu等〔9〕研究表明HMGB1预处理可以降低大鼠心梗面积，减少IL-6以及LDH的表达，保护心肌IR损伤。Oozawa等〔10〕给予外源性HMGB1单克隆抗体，干预IR心肌后，血浆心肌酶升高、心肌梗死面积扩大。Kim等〔11〕研究证实抗HMGB1抗体可以减轻善缺血后脑梗死损伤。HMGB1作为炎症因子，在IR损伤中的重要作用，因此寻找一种能够调控HMGB1的方法，减轻心肌IR损伤，就是以HMGB1为切入点，深入研究TSA对心肌IR后HMGB1的影响。

本研究提示TSA预处理有心肌保护的作用;丹参酮预处理可以减轻I/R损伤，降低血浆HMGB1等炎症介质的表达，抑制心肌HMGB1表达，减少心肌炎症反应。

4　参考文献

1Zhan MQ，Zheng YL，Zhai CL，et al．Sodium tanshinone TSA sulfonate protects rat myocardium against ischemia-reperfusion injury via activation of PI3K/Akt/FOXO3A/Bim pathway〔J〕．Acta Pharmacol Sin，2013; 34(11) : 1386-96．

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4郑智，韩少杰，任大宏.丹参对自发性高血压大鼠左室肥厚及心脏局部醛固酮的作用［J］.中华急诊医学杂志，2002; 11(1) : 22-4.

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7郭张强，成忠，李论，等.丹参酮ⅡA对急性心肌梗死无复流作用研究〔J〕．临床心血管病杂志，2011; 3(27) : 184-6.

8Iuza C，Bustin M，Talwar S，et al．Inflammation promoting activity of HMGB1 on human microvascular endothelial cells〔J〕．Blood，2003; 101 (7) : 2652-60.

9Hu X，Jiang H，Cui B，et al．Preconditioning with high mobility group box 1 protein protects against myocardial ischemia reperfusion injury〔J〕．Int J Cardiol，2010; 145(1) : 111-2.

10Oozawa S，Modri S，Kanke T，et al．Effects of HMGB1 on ischemia reperfusion injury in the rat heart〔J〕．Circ J，2008; 72(7) : 1178-84.

11Kim JB，Lim CM，Yu YM，et al．Induction and subcellular-localization of high-mobility group box-1(HMGB1) in the postischemic rat brain〔J〕．J Neurosci Res，2008; 86(5) : 1125-31.

〔2014-03-25修回〕

(编辑袁左鸣/滕欣航)

通讯作者:周斌全(1971-)，男，主任医师，主要从事心肌缺血再灌注研究。

基金项目:浙江省嘉兴市科技研究计划项目(No.2013AY21042-6)

〔中图分类号〕R541.4

〔文献标识码〕A

〔文章编号〕1005-9202(2015) 15-4185-03;

doi:10.3969/j.issn.1005-9202.2015.15.033