To ll样受体5激动剂CBLB502对7.0Gy 60Co γ射线照射恒河猴的辐射防护作用观察

申星，熊国林，谢玲，郭玲玲，李明，赵艳芳，王磊，洪剑，杨萌，赵黎，彭瑞云，王勇，杨晓明，罗庆良，余祖胤，葛常辉，邢爽

近年来，To ll样受体(To ll-like recep to r，TLR)信号通路的调控已成为研究热点[1]，目前已研发出多种TLR激动剂用于抗感染、抗肿瘤以及治疗自身免疫性疾病[2]。基于刺激TLR、调节核转录因子κB(NF-κB)信号通路发挥抗辐射损伤作用的研究发现了一系列新的辐射防护剂[3-5]，其中以TLR5激动剂的作用最强，能同时防护骨髓和肠道的辐射损伤，对重度以上骨髓型放射病有较好的辐射防护作用[5]。TLR5广泛表达于树突细胞、巨噬细胞以及肠黏膜固有层内皮细胞的表面，能够被细菌鞭毛蛋白或其衍生物CBLB502识别，并激活NF-κB信号通路，从而抑制细胞凋亡、抵抗机体氧化损伤[6]。CBLB502是经过改构的鞭毛蛋白衍生物，高效且免疫原性低，研究表明其对致死剂量照射的小鼠和猕猴均有显著的保护作用[5,7-8]。为进一步探索CBLB502的辐射防护作用，本研究以恒河猴为模型动物，采用辐射防护效果较好的WR-2721(氨磷汀，阿米福汀)[9]作为阳性对照药物，观察了不同剂量CBLB502对7.0Gy60Co γ射线全身照射恒河猴的防护作用，旨在为CBLB502的临床应用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物 30只健康成年恒河猴购自北京协尔鑫生物资源研究所，雌雄各半，体重5.0±1.0kg[动物质量合格证号：SCXK-(京)2005-0005]。动物饲养于军事医学科学院实验动物中心普通级猴实验室内，24h负压通风换气，室温18～24℃，相对湿度40%～70%，10h日光灯照明，14h黑暗，每天冲洗清洁笼具2次。动物到达后单笼单养，除饲以军事医学科学院实验动物中心配制的猴用标准饲料外，适当给予新鲜水果蔬菜等加强营养，消毒凉水置笼内自由饮用。动物饲养设施合格证号：SYXK-(军)2007-004。动物实验均按照军事医学科学院实验动物伦理委员会要求执行。

1.2 分组 依据性别、体重和外周血白细胞计数将入选的30只恒河猴分为对症治疗组、WR-2721组和CBLB502 2.5、10、40μg/kg组，每组6只。此外，预备3只体重为6～12kg的健康成年恒河猴用作对症治疗中输血时的供血猴。

1.3 给药方法 CBLB502注射液由北京放射医学研究所研制，批号20100613，4.0m g/支(1.0m l)，为无色澄明水溶液。WR-2721由大连美罗大药厂生产，白色冻干粉剂，400m g/瓶，批号53090902。不同剂量CBLB502和WR-2721均于照射前0.5h一次肌肉注射，对症治疗组肌肉注射等体积生理盐水(0.3m l/kg)。

1.4 模型制备与对症支持治疗 采用军事医学科学院放射与辐射医学研究所的60Co γ射线放射源，照射前10m in用3%戊巴比妥钠(30m g/kg)静脉注射麻醉恒河猴，将麻醉猴固定于特制照射木箱内行7.0Gy一次全身双侧照射，照射距离为4.75m，照射剂量率为13.00～13.52cGy/m in。为防止照射动物在观察期内过早死亡影响实验结果，依实验动物伦理及福利要求，受试动物在相同原则下均给予综合对症治疗，主要措施包括抗感染、抗出血、输血、维持水电解质和酸碱平衡、补充营养等。肠道灭菌：自照前3d开始，给予庆大霉素16万U+甲硝唑0.4g口服，1次/d，连续3d。预防感染：动物外周血白细胞数低于1×109/L时开始使用抗生素(青霉素80万U/d，肌肉注射，头孢噻肟钠1.0g/d，静脉注射)，根据病情及时调整、更换，连续3d外周血白细胞数超过1×109/L时停药。条件输血：动物外周血小板(PLT)低于50×109/L时，隔天一次静脉输注新鲜全血30m l，输注前均经15Gy60Co γ射线照射。

1.5 观察指标 观察照射后动物一般体征并检测外周血象，取照射后1d的外周血细胞和照射后39d的骨髓细胞进行造血细胞集落培养。观察动物存活情况，死亡动物即时解剖、存活动物实验结束时采用安乐死方式处死，取胸骨、淋巴结、小肠进行组织病理学检查，上述脏器和组织用中性福尔马林固定，常规制片、切片和染色后光镜下观察。

1.6 统计学处理 采用SPSS 19.0软件进行统计分析，采用Orig in Pro 9.0软件包作图。计量资料以±s表示，血小板减少症持续时间和生存率组间差异比较采用Kap lan-Meier检验。外周血细胞数比较采用重复测量的方差分析(repeated m easures data of ANOVA)，造血细胞集落数比较采用单因素方差分析(one-w ay ANOVA)，进一步两两比较采用LSD-t检验或Dunnett t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 7.0Gy γ射线全身照射猴损伤程度 7.0Gy60Co γ射线全身照射后，各组实验猴造血功能均严重受损，外周血淋巴细胞数迅速下降，照射后48h降至0.5×109/L左右，并于照射后第7天开始陆续出现发热症状，最高体温达40.4℃，发热期间动物食欲减退甚至拒食，体重明显减轻。病程极期，各组实验猴外周血白细胞、中性粒细胞和血小板数均明显减少，发生血细胞减少症。对症治疗猴于照射后17d开始出现死亡，其中4只猴在照射后3周内死于严重感染和出血并发症，存活时间为19.4±1.7d，40d时存活数仅为2只。对死亡猴进行组织病理学分析见骨髓腔空虚，广泛出血，造血细胞显著减少；脾脏广泛出血，红髓白髓分界不清，淋巴细胞明显减少，脾小体结构消失；肠黏膜剥脱、出血，黏膜上皮细胞嗜酸性变，间质细胞减少，淋巴细胞固缩等。根据一般临床表现、造血损伤程度和存活情况，参考急性放射病的分型分度标准[10]，本实验条件下，7.0Gy γ射线全身照射猴发生了重度骨髓型急性放射病。

2.2 CBLB502对7.0Gy γ射线照射猴存活和体征的影响 7.0Gy60Co γ射线照射后各组实验猴均出现发热症状，体重呈下降趋势。CBLB502 2.5、10、40μg/kg组发热动物数少于对症治疗组，除其中1只实验猴在照射后36d死于疱疹病毒引发的感染外，其他动物全部存活。WR-2721组照射后17d因外周血小板严重减少死亡1只，对症治疗组照射后40d内死亡4只，死亡动物存活时间为19.4±1.7d(表1)。该结果表明，照射前0.5h单次肌肉注射CBLB502可明显提高7.0Gy γ射线全身照射所致重度急性放射病实验猴的存活率，改善其生存质量。

表1 7.0Gy γ射线全身照射恒河猴体征及存活情况(n=6)Tab. 1 Signs and survival of Rhesus monkey irradiated with 7.0Gy γ-ray (n=6)

2.3 CBLB502对7.0Gy γ射线照射猴外周血小板数的影响 CBLB502治疗组血小板数在照射后早期有一过性下降，在照射后2～7d明显低于对症治疗组(P＜0.05)，各组照射猴外周血小板数自照射后第5天开始急剧下降，第13～15天达最低值，CBLB502 10μg/kg和40μg/kg组最低值明显高于对症治疗组(P＜0.05，表2)，CBLB502 40μg/kg组血小板减少和缺乏(血小板数＜50×109/L，为临床输血指征)持续时间明显低于CBLB502 2.5μg/kg组和WR-2721组(P＜0.05，表3)。WR-2721组血小板数变化趋势与

表2 CBLB502对7.0Gy γ射线照射恒河猴外周血细胞数最低值的影响(×109/L，±s)Tab. 2 Effects of CBLB502 on peripheral b lood nad irs of Rhesus monkey irrad iated with 7.0Gy γ-ray (×109/L, ±s)

表2 CBLB502对7.0Gy γ射线照射恒河猴外周血细胞数最低值的影响(×109/L，±s)Tab. 2 Effects of CBLB502 on peripheral b lood nad irs of Rhesus monkey irrad iated with 7.0Gy γ-ray (×109/L, ±s)

(1)P＜0.05 com pared with IR group; (2)P＜0.05 com pared with WR-2721 group. PLT. Platelets; WBC. White b lood cells; NEUT. Neutrophil;LYM. Lym phocytes

Hem ocyte IR WR-2721 CBLB502 (μg/kg)2.5 10 40 PLT 14.7±9.4 28.8±9.3 33.6±8.9 47.5±13.0(1) 53.7±38.2(1)WBC 0.2±0.1 0.4±0.1 0.4±0.2 0.6±0.2(1) 0.8±0.7(1)NEUT 0.01±0.01 0.03±0.03 0.02±0.02 0.09±0.07 0.13±0.15(1)(2)LYM 0.19±0.14 0.31±0.10 0.15±0.03(2) 0.33±0.10(1) 0.25±0.12

表3 CBLB502对7.0Gy γ射线照射恒河猴外周血血小板数的影响(±s)Tab. 3 Effects of CBLB502 on peripheral blood p latelet count of Rhesus monkey irrad iated with 7.0Gy γ-ray (±s)

表3 CBLB502对7.0Gy γ射线照射恒河猴外周血血小板数的影响(±s)Tab. 3 Effects of CBLB502 on peripheral blood p latelet count of Rhesus monkey irrad iated with 7.0Gy γ-ray (±s)

(1)P＜0.05 com pared with WR-2721 group; (2)P＜0.05 com pared with CBLB502 2.5μg/kg g roup. Recovery initiation tim e w as the tim e point when PLT＞100×109/L began to occur. Since 4/6 Rhesus monkeys in the IR group died during the crisis period, the duration of the PLT nad ir w as no t ca lcu lated.

Group Du ration of PLT nad ir (d)PLT recovery in itiation (d)＜100×109/L ＜50×109/L WR-2721 5.4±1.3 3.2±1.3 20.2±2.3 CBLB502 2.5μg/kg 12.2±5.8(1)4.8±3.9 21.0±2.0 CBLB502 10μg/kg 5.0±4.0(1)1.3±1.9(1)(2) 21.3±8.7 CBLB502 40μg/kg 3.8±2.8(1)1.3±1.6(1)(2) 15.5±8.3

CBLB502 2.5μg/kg组相似，恢复稍快于对症治疗组。照射后39d各组血小板数相当，达照射前水平的56%～76%(图1A)。

2.4 CBLB502对7.0Gy γ射线照射猴外周血白细胞数的影响 CBLB502 10μg/kg和40μg/kg组照射猴外周血白细胞数最低值均明显高于对症治疗组(P＜0.05，表2)，且开始恢复时间提前(图1B)。CBLB502 40μg/kg组白细胞数在照射后13d明显高于WR-2721组和对症治疗组(P＜0.05)，15～17d明显高于对症治疗组(P＜0.01)，其白细胞数减少和缺乏(白细胞数＜1.0×109/L)持续时间明显低于CBLB502 2.5μg/kg组和对症治疗组(P＜0.05，表4，图1B)。中性粒细胞和淋巴细胞数变化趋势(图1C、D)与白细胞基本一致，CBLB502 40μg/kg组照射后15d

表4 CBLB502对7.0Gy γ射线全身照射恒河猴外周血白细胞的影响(±s)Tab. 4 Effects of CBLB502 on peripheral b lood WBC count of Rhesus m onkey irrad iated with 7.0Gy γ-ray (±s)

表4 CBLB502对7.0Gy γ射线全身照射恒河猴外周血白细胞的影响(±s)Tab. 4 Effects of CBLB502 on peripheral b lood WBC count of Rhesus m onkey irrad iated with 7.0Gy γ-ray (±s)

Group Du ration of WBC nad ir (d)WBC recovery in itiation (d)＜2.0×109/L ＜1.0×109/L WR-2721 16.2±3.1 12.0±3.2 21.4±2.6 CBLB502 2.5μg/kg 17.8±2.6 12.8±3.3 22.6±2.2 CBLB502 10μg/kg 16.3±3.3 10.5±5.2 21.0±2.8 CBLB502 40μg/kg 12.5±6.4(1) 7.0±5.8(1)(2) 20.0±2.8

(1)P＜0.05 com pared with WR-2721 group; (2)P＜0.05 com pared with CBLB502 2.5μg/kg group. Recovery initiation tim e was the tim e point when WBC＞2.0×109/L began to occur. Since 4/6 Rhesus monkeys in IR group died during crisis period, duration of WBC nadir w as no t ca lcu lated中性粒细胞数明显高于对症治疗组和WR-2721组(P＜0.05)，CBLB502 40和10μg/kg组照后各时间点的淋巴细胞绝对值相当，且在照射后17d均明显高于对症治疗组(P＜0.01，P＜0.05)。该结果提示，照射前0.5h单次肌肉注射CBLB502可促进7.0Gy γ射线全身照射恒河猴外周血白细胞数恢复，以40μg/kg组效果最佳，其疗效优于WR-2721。

图1 CBLB502对7.0Gy γ射线全身照射恒河猴外周血细胞数的影响Fig. 1 Effect of CBLB502 on peripheral b lood cells coun t of the Rhesus monkeys irrad iated with 7.0Gy γ-ray A. Plate let; B. Leucocyte; C. Neu troph il; D. Lym phocyte; E. Eryth rocyte; F. Reticu locyte

2.5 CBLB502对7.0Gy γ射线照射猴外周血红细胞和网织红细胞(RET)数的影响 恒河猴外周血红细胞数在照射后缓慢下降，极期时CBLB502 10、40μg/kg组红细胞数较其他各组略低(图1E)。外周血中RET数可以间接反映受照射机体造血功能损伤程度及恢复情况，检测结果表明：7.0Gy γ射线照射后9 d内各组RET绝对值无明显差异，对症治疗组RET低值持续至第21天才开始逐渐恢复，而CBLB502治疗组外周血RET于照射后9～15d有小幅升高且高于同期对症治疗组，第15天后CBLB502 2.5μg/kg组与对症治疗组恢复速度相当，但CBLB502 10、40μg/kg组迅速上升并明显高于同期CBLB502 2.5μg/kg组、对症治疗组及WR-2721组(P＜0.05，图1F)。该结果提示，照射前0.5h单次肌肉注射CBLB502可加速7.0Gy γ射线全身照射恒河猴造血功能的恢复。

2.6 CBLB502对7.0Gy γ射线照射猴骨髓和外周血造血细胞集落形成的影响 照射后1d外周血造血祖细胞集落培养结果显示，CBLB502治疗组巨核细胞集落形成单位(co lonyform ing unit-m egakaryocyte，CFU-MK)、红系爆式集落形成单位(bu rst-fo rm ing un it-eryth roid，BFU-E)和粒细胞-巨噬细胞集落形成单位(colonyform ing unit-granulocyte m acrophage，CFU-GM)集落数均有所增加，但是受样本数量所限，仅CBLB502 2.5μg/kg组CFU-GM集落数优于对症治疗组、WR-2721组，差异有统计学意义(P＜0.05，表5)。第39天骨髓造血集落培养结果显示，各组集落生成数相当，提示此时存活照射猴的造血损伤均已得到恢复(表6)。

表5 7.0Gy γ射线照射后1d各组外周血细胞集落形成单位数(/2×104单个核细胞，±s)Tab. 5 Colony counting in peripheral b lood of the anim als 1-day after radiation with 7.0Gy γ-ray (/2×104 m ononuclear cells, ±s)

表5 7.0Gy γ射线照射后1d各组外周血细胞集落形成单位数(/2×104单个核细胞，±s)Tab. 5 Colony counting in peripheral b lood of the anim als 1-day after radiation with 7.0Gy γ-ray (/2×104 m ononuclear cells, ±s)

CFU-MK. Co lony form ing unit-m egakaryocyte; BFU-E. Burstform ing unit-erythroid; CFU-E. Colony form ing unit erythroid; CFU-GM.Colony form ing unit-granulocyte m acrophage; CFU-M ix. M ixed colonyfo rm ing unit. (1)P＜0.05 com pared with CBLB502 2.5μg/kg g roup

Group CFU-MK BFU-E CFU-E CFU-GM CFU-M ix IR 0.6±0.90.5±1.00.1±0.3 4.1±2.8(1)0.1±0.3 WR-2721 0.3±0.40.8±0.9 0.0 5.8±2.8(1) 0.0 CBLB502 2.5μg/kg 1.4±0.70.4±0.40.5±0.9 14.8±6.7 0.5±0.4 CBLB502 10μg/kg 2.0±2.02.9±3.9 0.0 7.2±4.1(1) 0.0 CBLB502 40μg/kg 1.1±0.33.3±3.3 0.0 9.1±5.2 0.6±0.9

2.7 CBLB502对7.0Gy γ射线全身照射恒河猴对症治疗的影响 统计各组动物接受对症治疗的用药情况发现，CBLB502 40μg/kg组有2只动物照射后外周血小板数一直＞100×109/L，不需输血或接受止血药治疗，另4只动物接受止血药治疗时间较WR-2721组明显缩短(P＜0.05)，且输血量较WR-2721组及CBLB502 2.5μg/kg组明显减少(P＜0.05，表7)。该结果提示，照射前0.5h单次肌肉注射40μg/kg CBLB502可明显缩短7.0Gy γ射线全身照射恒河猴接受抗生素和止血药治疗的时间并减少输血量。

2.8 各组7.0Gy照射猴组织病理学改变 组织病理学观察显示，照射前0.5h单次肌肉注射CBLB502可明显减轻7.0Gy60Co γ射线全身照射后骨髓、肠道、肠系膜淋巴结等组织的损伤，其中CBLB502 10μg/kg和40μg/kg组的改善作用更为突出，主要表现为骨髓、肠道、肠系膜淋巴结组织结构良好，细胞数量增加，血管淤血、出血减轻或消失。

表6 7.0Gy γ射线照射后39d各组骨髓血细胞集落形成单位数(/2×104单个核细胞，±s)Tab. 6 Colony counting in bone m arrow of the anim als 39 days after radiation with 7.0Gy γ-ray (/2×104 mononuclear cells, ±s)

表6 7.0Gy γ射线照射后39d各组骨髓血细胞集落形成单位数(/2×104单个核细胞，±s)Tab. 6 Colony counting in bone m arrow of the anim als 39 days after radiation with 7.0Gy γ-ray (/2×104 mononuclear cells, ±s)

CFU-MK. Colony form ing unit-m egakaryocyte; BFU-E. Burstform ing unit-erythroid; CFU-E. Co lony form ing unit erythroid; CFUGM. Colony form ing unit-granulocyte m acrophage; CFU-M ix. M ixed co lony-form ing unit. Since 4/6 Rhesus monkeys from IR group died during crisis period, colony counting was not done to bone m arrow

Group CFU-MK BFU-E CFU-E CFU-GM CFU-M ix WR-2721 8.9±2.814.2±1.95.6±1.994.8±16.05.2±3.1 CBLB502 10μg/kg9.1±1.613.5±1.53.8±1.2102.6±3.72.4±0.4 CBLB502 10μg/kg7.2±1.514.8±3.44.9±1.792.5±13.64.5±2.1 CBLB502 40μg/kg6.5±1.514.1±5.73.9±1.682.4±14.23.6±1.7

表7 各组对症治疗情况(±s)Tab. 7 Sym p tom atic therap ies of experim en tal g roup s (±s)

表7 各组对症治疗情况(±s)Tab. 7 Sym p tom atic therap ies of experim en tal g roup s (±s)

(1)P＜0.05 com pared with WR-2721 group; (2)P＜0.05 com pared with CBLB502 2.5μg/kg group. Since 4/6 Rhesus monkeys from IR group died du ring crisis period, sym p tom atic therapy du ration w as no t calcu lated

Item WR-2721 CBLB502 (μg/kg)2.5 10 40 An tibio tics treatm en t du ration (d) 20.2±2.6 20.6±4.2 19.3±3.1 20.3±4.6 Hem ostatic treatm ent duration (d) 8.3±3.0 9.6±2.9 6.7±4.2 4.3±3.7(1)To ta l transfusion vo lum e (m l) 95.0±22.6 75.0±33.2 20.0±15.5(1)(2) 37.5±56.8(1)(2)

骨髓：对症治疗组4只恒河猴在21d内死亡，组织病理学观察见骨髓腔空虚，广泛出血，造血细胞显著减少，残留的造血细胞以成熟细胞为主，胞核固缩，并见大量含铁血黄素沉积(图2A)。WR-2721组可见骨髓腔少量出血，造血细胞增生，以粒细胞为主，其结构损伤较对症治疗组有所改善(图2B)。CBLB502 40μg/kg组骨髓均见造血细胞增生活跃，形态良好，核分裂象多见，出血减少(图2C)。该结果提示，CBLB502预防给药对7.0Gy γ射线全身照射猴的骨髓组织有明显保护作用。

肠道：对症治疗组恒河猴肠黏膜脱落、出血，肠腔散在细胞碎片，黏膜上皮细胞可见嗜酸性变，间质细胞减少，淋巴细胞固缩，隐窝未见明显增生(图3A)。WR-2721组存活猴肠上皮排列整齐、结构完整，隐窝和淋巴细胞增生，有少量出血，其结构损伤较对症治疗组减轻(图3B)。CBLB502 40μg/kg组恒河猴肠黏膜上皮细胞排列整齐，隐窝明显增生，淋巴细胞数目增加，间质细胞丰富、形态正常(图3C)，其结构损伤较对症治疗组和WR-2721组明显改善。

图2 7.0Gy照射猴骨髓病理组织学观察(HE ×400)Fig. 2 Histopatho logical observation of bone m arrow of Rhesus m onkey irrad iated with 7.0Gy γ-ray (HE ×400)A. Anim al in IR g roup and d ied on 21d; B. Anim al in WR-2721 g roup; C. Anim al in CBLB502 40μg/kg g roup

图3 7.0Gy照射猴小肠病理组织学观察(HE ×200)Fig. 3 Histopatho log ical observation of sm all in testine of Rhesus m onkey irrad iated with 7.0Gy γ-ray (HE ×200)A. An im a l in IR g roup and d ied on 21d; B. An im a l in WR-2721 g roup; C. Anim a l in CBLB502 40μg/kg g roup

肠系膜淋巴结：对症治疗组肠系膜淋巴结皮质变薄，皮髓分界不清，淋巴细胞显著减少，核固缩、溶解，可见含铁血黄素沉积(图4A)。WR-2721组肠系膜淋巴结皮髓质可见少量淤血、出血，淋巴细胞坏死和增生并存，可见核碎片和核分裂结构，其结构损伤较对症治疗组有所改善(图4B)。CBLB502 40μg/kg组恒河猴肠系膜淋巴结出血减少，皮髓质分界清晰，淋巴细胞增生活跃(图4C)，其结构损伤较对症治疗组和WR-2721组明显改善。

图4 7.0Gy照射猴肠系膜淋巴结病理组织学观察(HE ×200)Fig. 4 Histopathological observation of m esenteric lym ph node of Rhesus monkey irradiated with 7.0Gy γ-ray (HE ×200)A. Anim al in IR g roup and d ied on 21d; B. Anim al in WR-2721 g roup; C. Anim al in CBLB502 40μg/kg g roup

3 讨 论

本研究以7.0Gy60Co γ射线全身照射恒河猴为模型动物，观察了CBLB502对重度骨髓型急性放射病的防护效果。对动物体征、存活率与存活时间、造血功能的损伤与重建、非造血器官及组织的损伤和修复等方面进行比较分析发现：7.0Gy γ射线全身照射后，对症治疗组恒河猴在3周内死亡4只，死亡动物存活时间为19.4±1.7d；所有动物均出现不同程度的发热，体温最高达40.4℃；照射前0.5h单次肌肉注射CBLB502可明显提高动物活存率，其中2.5μg/kg CBLB502提高存活的效果与30m g/kg WR-2721相同(均存活5/6)；CBLB502 10、40μg/kg组恒河猴全部存活，发热动物数减少，体重下降幅度较对症治疗组有所改善。照前0.5h单次肌肉注射2.5、10、40μg/kg CBLB502均可明显促进7.0Gy γ射线全身照射恒河猴造血功能恢复，升高外周血白细胞、血小板和中性粒细胞数的最低值，缩短外周血细胞数最低值持续时间并使其开始恢复时间提前。此外，CBLB502可明显减轻7.0Gy60Co γ射线照射后骨髓、淋巴结和肠道等主要造血、免疫和消化器官的组织损伤。照射后39d骨髓造血细胞集落培养并未观察到CBLB502可促进造血细胞集落的生成，可能是因为骨髓样本采集时间较晚，此时各组动物的造血功能均已恢复正常。本研究结果显示，抗辐射损伤作用以CBLB502 40μg/kg组最佳，10μg/kg CBLB502仍具有较好的辐射防护效果；经比较发现，照前0.5h单次肌肉注射40μg/kg CBLB502对7.0Gy γ射线全身照射恒河猴的辐射防护作用明显优于国际公认的辐射防护剂WR-2721(照前0.5h单次肌内注射30m g/kg)。

TLR是最先被发现的模式识别受体，在人类固有免疫和获得性免疫应答中发挥着重要作用[11-12]，迄今为止在人体内已发现其11个家族成员，且不同的TLR有其相应的配体。目前研究发现，TLR2/6、TLR5以及TLR9的激动剂均能发挥辐射防护作用[2-5]，其中细菌鞭毛蛋白是TLR 5已知的唯一配体。CBLB502是利用大肠埃希菌制备的重组蛋白，包含了沙门菌鞭毛蛋白完整的N末端和C末端保守的结构域，不但可在常温下长时间保存而不丧失药物活性，而且与鞭毛蛋白具有同样的稳定性，毒性和免疫原性却大为较低[5]。利用TLR5基因敲除小鼠进行研究发现，CBLB502可通过TLR5依赖途径激活NF-κB信号通路发挥辐射防护效应，其具体机制包括：①诱导IAP、Bc l-2表达，抑制辐射所致的细胞凋亡；②诱导超氧化物歧化酶2的表达，促进机体清除氧自由基；③诱导多种具有辐射防护作用的细胞因子如G-CSF和IL-6的表达，刺激白细胞和血小板的生成[5]。此外，不同于造血刺激生长因子类辐射防护剂，CBLB502在保护造血系统的同时，还对消化系统有明确的辐射防护作用。目前，CBLB502的抗氧化损伤作用已在小鼠肾脏缺血再灌注损伤研究中得到证实[13]。由于对放射性肠道上皮损伤有显著的治疗作用，CBLB502也被用于头颈部放疗所致的皮炎及口腔黏膜炎的实验治疗，可减轻辐射所致的上皮细胞损伤，且不降低肿瘤细胞对辐射的敏感性[14]。值得关注的是，有报道称CBLB502对放射性间质性肺炎和肺纤维化也有明显的预防作用[15]。相信随着研究的不断深入，CBLB502作为安全、有效的新型辐射防护剂，可拥有更加广阔的应用前景。

[1] M iggin SM, O Neill LA. New insights into the regu lation of TLR signa ling[J]. J Leukoc Bio l, 2006, 80(2): 220-226.

[2] Hedayat M, Takeda K, Rezaei N. Prophylatic therapeu tic im p lications of Toll-like recep tor ligands[J]. Med Res Rev, 2012,32(2): 294-325.

[3] Saha S, Bhan ja P, Liu L, et al. TLR9 agonist p rotects mice from radiation-induced gastrointestinal synd rom e[J]. PLoS One,2012, 7(1): e29357.

[4] Singh VK, Ducey EJ, Fatanmm i OO, et al. CBLB613: A TLR 2/6 agonist, natural lipopep tide of m ycop lasm a arginini, as a novel rad iation counterm easu re[J]. Rad iat Res, 2012, 177(5): 628-642.

[5] Burdelya LG, Krivokrysenko VI, Tallant TC, et al. An agonist of To ll-like recep tor 5 has rad iop rotective activity in m ouse and p rim ate m ode ls[J]. Science, 2008, 320(5873): 226-230.

[6] Wang Y, Meng AM, Lang HN, et al. Activation of nuclear factor κB in vivo selectively p rotects the m urine sm all intestein against ionizing rad iation-induced dam age[J]. Cancer Res, 2004,64(17): 6240-6246.

[7] Eaves-Pyles T, Mu rthy K, Liaudet L, et al. Flagellin, a nove l m ed iator of Salm onella-induced ep ithelial activation and system ic inflamm ation: I kappa B alpha degradation, induction of nitric oxide synthase, induction of p roinflamm atory m ediators,and card iovascu lardysfunction[J]. J Imm uno l, 2001, 166(2):1248-1260.

[8] Vijay-kum ar M, Aitken JD, Sanders CJ, et al. Flagellin treatm ent p rotects against chem icals, bacteria, viruses, and radiation[J]. J Imm uno l, 2008, 180(12): 8280-8285.

[9] Cap izzi RL, Oster W. Chem op rotective and rad iop rotective e ffects of am ifostine: an update of clin ical trials[J]. In t J Hem ato l, 2000, 72(4): 425-435.

[10] Donnelly EH, Nem hauser JB, Sm ith JM, et al. Acute rad iation syndrom e: assessm ent and m anagem ent[J]. South Med J, 2010,103(6): 541-544.

[11] Li YY, Guan YQ, M iao W, et al. Effect of ato rvastatin on TLR4 exp ression and downstream signaling in atherosclerotic rabbits[J]. J Shandong Univ (Health Sci), 2014, 52(6): 1-6. [李悦妍, 关玉庆, 苗伟, 等. 阿托伐他汀对动脉粥样硬化模型兔To ll样受体4及其下游信号表达的影响[J]. 山东大学学报(医学版), 2014, 52(6): 1-6.]

[12] Liu YF, Wang ZG, Tang HW, et al. Protective effect of ulinastatin on inhalation lung in jury caused by black gunpow der sm oke in rats and its inhibitory effect on the m RNA exp ression of IL-1β and TNF-α[J]. Med J Chin PLA, 2014, 39(3): 235-239. [刘一凡, 王正冠, 唐红卫, 等. 乌司他丁对黑火药烟雾所致吸入性肺损伤大鼠的保护作用以及对IL-1β、TNF-α基因表达的抑制作用[J]. 解放军医学杂志, 2014, 39(3): 235-239.]

[13] Fukuzaw a N, Petro M, Baldw in WM 3rd, et al. A TLR5 agonist inh ibits acu te renal ischem ic failu re[J]. J Imm uno l, 2011,187(7): 3831-3839.

[14] Burdelya LG, Gleiberm an AS, Toshkov I, et al. To ll-like recep tor 5 agonist p rotects mice from derm atitis and oral m ucositis caused by local radition: Im plications for head-and-neck cancer radiotherapy[J]. In t J Rad iation Onco l Bio l Phys, 2012, 83(1):228-234.

[15] Wang ZD, Qiao YL, Tian XF, et al. To ll-like recep tor 5 agonism p rotects mice from rad iation pneum onitis and pu lm onary fib rosis[J]. Asian Pac J Cancer Prev, 2012, 13(9): 4763-4767.