部分茶竿竹亚属竹种亲缘关系的荧光AFLP分析

钟　浩，高贵宾，潘雁红，吴良如*

(1.国家林业局竹子研究开发中心，浙江杭州310012；2.浙江省竹子高效加工重点实验室，浙江杭州310012)



部分茶竿竹亚属竹种亲缘关系的荧光AFLP分析

钟浩1,2，高贵宾1,2，潘雁红1,2，吴良如1,2*

(1.国家林业局竹子研究开发中心，浙江杭州310012；2.浙江省竹子高效加工重点实验室，浙江杭州310012)

摘要：利用荧光AFLP技术，选择EcoRⅠ/MseⅠ酶切组合，应用16对(EcoRⅠ+3)/(MseⅠ+3)引物组合进行选择性扩增，检测9个茶竿竹亚属竹种基因组DNA多态性。结果共获得1 473条谱带，平均每对引物92条，其中多态性条带1 092条，PPB为74.1%。聚类结果表明，正种茶竿竹及其4个变种以相似系数0.78聚在一起，其中铁厘茶竿竹和白水茶竿竹之间的相似系数达到最高为0.88，从分子水平上佐证了铁厘茶竿竹和白水茶竿竹是正种茶竿竹的2个变种。

关键词：正种茶竿竹；AFLP；多态性；聚类；相似系数

正种茶竿竹(Pseudosasaamabilis)，属禾本科竹亚科(Bambusoideae Nees)矢竹属(Pseudosasa)茶竿竹组的模式种[1]，是我国特产的珍贵竹种之一，竹秆通直、节平、壁厚、光滑、坚韧、材质优良，可制作各种竹器家具、雕刻装饰、钓鱼竿、滑雪杖、旗竿、篱笆等。正种茶竿竹竹材纤维含量达53.2%，适于造纸和制人造丝浆[2]。竹材经沙洗加工后，洁白如象牙，不易被虫蛀且耐腐蚀性强，燃烧后竹灰洁白不成炭，因此又被称为“沙白竹”、“钢竹”，是我国传统出口商品竹，在国际市场颇负盛名。正种茶竿竹主产于广东、福建、湖南、广西等省区的丘陵平原或河流沿岸及山坡地带，近年江苏、浙江有引种栽培，生长尚佳，模式标本采自广东省肇庆市广宁县[3]。

中国植物志记载，茶竿竹亚属有16种5变种[1]，均分布在我国华南、华东地区之南部，而徐英宝[2]等报道，广东省肇庆市怀集县有3个变种，即正种茶竿竹(Pseudosasaamabilisvar.amabilis)、铁厘茶竿竹(Pseudosasaamabilisvar.ferrea)和白水茶竿竹(Pseudosasaamabilisvar.peshuiensis)，但后2个变种在植物志中没有记载，也未见相关文献报道。本文利用AFLP分子标记对部分茶竿竹亚属竹种进行亲缘关系分析，从分子水平探讨广东省肇庆市怀集县铁厘茶竿竹和白水茶竿竹的分类地位。

扩增片段长度多态性(Amplified Fragment Length Polymorphisms，AFLP)是1993年由荷兰科学家Vos等发展起来的一种检测DNA多态性的方法，是一种以PCR和RFLP为基础的DNA指纹图谱技术[4]，已广泛应用于竹类植物遗传多样性和亲缘关系的研究[5]。

1材料与方法

1.1材料

收集了包括茶竿竹在内的5个变种，即正种茶竿竹(P.amabilis)、福建茶竿竹(P.amabilisvar.convexa)、薄箨茶竿竹(P.amabilisvar.tenuis)、铁厘茶竿竹(P.amabilisvar.ferrea)和白水茶竿竹(P.amabilisvar.peshuiensis)；还采集了茶竿竹亚属的其它4个种，即斑箨茶竿竹(P.notate)、笔竿竹(P.guangxianensis)、近实心茶竿竹(P.subsolida)和尖箨茶竿竹(P.acutivagina)(表1)。其中福建茶竿竹、薄箨茶竿竹、笔竿竹、近实心茶竿竹、斑箨茶竿竹和尖箨茶竿竹采自福建华安竹种园；正种茶竿竹、铁厘茶竿竹和白水茶竿竹采自广东省肇庆市怀集县。采集的样品均经过福建省华安县林业局华安竹种园邹跃国高级工程师的鉴定。采集竹子嫩叶的混合样，经变性硅胶快速干燥后带回实验室置于-70 ℃冰箱保存备用。

表1　材料名称及编号

1.2方法

1.2.1基因组DNA的提取采用改良的CTAB法提取9个竹种的基因组DNA[6]，用Titertek-Berthold Colibri超微量分光光度计检测DNA的浓度和纯度，取1 μL在1%TAE琼脂糖凝胶上进行电泳检测DNA的质量，然后定量至100 ng/μL，-20 ℃保存备用。

1.2.2AFLP分析采用EcoRⅠ/MseⅠ酶切组合，对Vos等发明的方法[7]进行了优化。EcoRⅠ和MseⅠ对应的接头和预扩增引物由生工生物工程上海(股份)有限公司合成。接头序列：EcoRⅠ左接头5′-CTCGTAGACTGCGTACC-3′，右接头5′-AATTGGTACGCAGTCTAC-3′；MseⅠ左接头5′-GACGATGAGTCCTGAG-3′，右接头5′-TACTCAGGACTCAT-3′。选扩增引物试剂盒(AFLP© IRDye 700 Infrared Dye Selective Amplification Kit)购自基因有限公司，其中EcoRⅠ选扩引物由IRDye 700荧光标记。选扩增产物在Li-cor4300 DNA遗传分析系统上样电泳并自动进行数据采集。

1.2.3数据处理由Li-cor4300 DNA遗传分析系统采集到的特征数据矩阵计算单位引物多态性条带和多态性条带百分率(Percentage of Polymorphic Band,PPB)。利用NTSYS-pc(version2.10e)对数据进行分析，用SAHN Clustering进行非加权组平均法(UPGMA)进行聚类分析，并构建遗传多样性聚类图谱。

2结果与分析

2.1AFLP扩增片段的多态性

从常用的8×8对引物中筛选出16对扩增效果较好的引物(表2)对9个样品进行AFLP检测，由Li-cor4300 DNA遗传分析系统采集的数据可知，其扩增产物的分布范围在50～700 bp，图1是引物组合E-AAC/M-CTC的扩增结果。16对引物共扩增出1 473个条带，平均每对引物92条，其中多态性条带1 092条，PPB为74.1%。不同引物对的扩增效果差异很大，E-ACC/M-CAC扩增条带最丰富，扩增出134个条带；E-ACA/M-CTT扩增条带最少，仅扩增出45个条带。不同引物组合的PPB相差较大，从61.2%到87.2%不等，其中E-ACG/M-CAC引物组合的PPB最高为87.2%(表2，图1)。

表2　AFLP引物组合的多态性分析

M：IRDye© 700 Sizing Standard-50-700 bp；1～9：见表1　M:IRDye© 700 Sizing Standard-50-700 bp;1～9:See Tab.1图1　AFLP引物组合E-AAC/M-CTC对9个茶竿竹亚属竹种的扩增结果Fig.1　The amplification result of 9 Chagan-Bamboo species by AFLP primercombination E-AAC/M-CTC

2.2聚类结果与分析

采用SM系数，当遗传相似系数取阈值0.65时，可以分为两个大组。第一大组包括正种茶竿竹及其4个变种和茶竿竹亚属的其它2个种(笔竿竹和尖箨茶竿竹)，第二大组包括茶竿竹亚属的另2个种(近实心茶竿竹和斑箨茶竿竹)。第一大组中，正种茶竿竹及其4个变种以相似系数0.78聚在一起形成一个小组(图2中红框所示，以下称茶竿竹小组)，其中怀集县的2个茶竿竹变种铁厘茶竿竹和白水茶竿竹相似系数最高，为0.88，亲缘关系也最近。正种茶竿竹及其变种先与笔竿竹聚在一起，然后再与亲缘关系较远的尖箨茶竿竹聚在一起形成第一大组。

3结论与讨论

从聚类结果看，支持经典的茶竿竹亚属分类[1]。如笔竿竹与茶竿竹小组之间的相似系数达到了0.74，亲缘关系也较近，两者在形态上相似之处在于箨片线状披针形，基部稍向内收窄，箨鞘背部无斑点。主要区别为茶竿竹竿箨无箨耳，但有数条直立而先端波曲的繸毛，而笔竿竹竿箨具椭圆形的箨耳，其上有繸毛，形态上的关系得到了本文研究结果的支持。

怀集县的2个茶竿竹变种铁厘茶竿竹和白水茶竿竹之间的相似系数达到最高的0.88，从分子水平上佐证了它们是茶竿竹的2个变种，而且体现了一定的地理特异性(均采自广东省肇庆市怀集县)。

图2　9个茶竿竹亚属竹种基于SM相似系数的AFLP谱带UPGMA聚类图Fig.2　The UPGMA dendrogram of 9 Chagan-Bamboo species using SM coefficients

第二大组与第一大组之间的相似系数只有0.65，这也支持经典的分类系统，两者在形态上的主要区别为第一大组箨鞘背部无斑点，而第二大组箨鞘背部多少有些具斑点。第二大组的近实心茶竿竹和斑箨茶竿竹以相似系数0.73聚在一起，两者在形态上的主要区别有：近实心茶竿竹箨鞘的斑点不很清楚，箨鞘背部无毛，箨耳为小点状，叶耳不明显，具数条短繸毛；斑箨茶竿竹箨鞘的斑点明显，箨鞘背部被疏密不匀向下贴伏的刺毛，鞘基部还生有浅黄色绒毛，箨耳小，半圆形，密被细柔毛，耳缘生数条硬刚毛，叶耳和繸毛俱缺。

传统的AFLP分子标记多采用垂直板电泳和银染法检测[8-10]，本研究采用的荧光标记引物AFLP法，检测的灵敏度高于银染法，而且可运用SAGAMX软件进行电泳图自动读带并转化为0、1矩阵，然后进行分析，全过程自动化完成，与人工读取胶板银染法相比，很大程度上降低了系统误差与随机误差，提高了工作效率[11]。

本文的研究结果表明，AFLP分子标记是一种茶竿竹亚属内系统学检测的有效工具，当根据形态鉴别有困难时，可提供一种候选的，也是可靠的鉴别方法。

参考文献：

[1]耿伯介,王正平.中国植物志(第九卷第一分册)[M].北京:科学出版社,1996:639-659.

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[3]潘雁红,吴良如,高贵宾,等.茶竿竹研究与利用[J].竹子研究汇刊,2012,31(4):46-51.

[4]黄文坤,郭建英,万方浩,等.AFLP标记在植物遗传多样性研究中的应用[J].中国农学通报,2006,22(8):50-54.

[5]娄永峰,林新春,何奇江,等.哺鸡竹亲缘关系的AFLP和SRAP分析[J].分子植物育种,2010,8(1):83-88.

[6]Doyle J J,Doyle J L.A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue[J].Phytochemistry Bull,1987,19:11-15.

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[10]唐梅,何光华,裴炎.中籼杂交水稻亲本多态性的AFLP分析[J].遗传,2002,24(4):439-441.

[11]邱冬梅,孙继英,刘金,等.扩增片段长度多态性(AFLP)荧光标记和银染技术的比较分析[J].生命科学研究,2006,10(3):17-21.

An Analysis of Genetic Relationship among Some Chagan-Bamboo

Species by Using Fluorescent AFLP

ZHONG Hao1,2,GAO Gui-bin1,2,PAN Yan-hong1,2,WU Liang-ru1,2*

(1.China National Bamboo Research Center,Hangzhou 310012,China;2.Key Laboratory of High Efficient Processing of Bamboo of Zhejiang Province,Hangzhou 310012,China)

Abstract:Fluorescent amplified fragment length polymorphisms (AFLP) was used to study the DNA diversity of 9 Chagan-Bamboo species.Genomic DNA was digested withEcoRⅠ andMseⅠ enzymes and amplified with 16 (EcoRⅠ+3)/(MseⅠ+3) primer combinations.In the 9 samples,16EcoRⅠ -MseⅠ AFLP primer combinations produced 1 473 legible bands (92 bands per primer combination),of which 1 092 were polymorphic bands,the percentage of polymorphic band (PPB) was 74.1%.The cluster analysis of AFLP indicated thatPseudosasaamabilisand its 4 varieties belonged to one small group (their similar coefficient was 0.78),in which the similar coefficient betweenPseudosasaamabilisvar.ferreaandPseudosasaamabilisvar.peshuiensiswas 0.88.This proves thatPseudosasaamabilisvar.ferreaandPseudosasaamabilisvar.peshuiensisare two varieties ofPseudosasaamabilis.

Key words:Pseudosasaamabilis;AFLP;diversity;cluster;similar coefficient

作者简介：钟浩(1984—)，男，助理研究员，硕士生，主要从事竹子分子遗传研究，E-mail:13706710845@163.com；*通信作者：吴良如，副研究员，E-mail:boteatree@163.com。

基金项目：国家林业局竹子研究开发中心研究基金项目(ZXJJ201207)和浙江省科技计划项目(2014F10047)

收稿日期：2015-05-29修回日期：2015-09-17

中图分类号：Q943.2

文献标志码：A

文章编号：1000-2286(2015)06-1033-04

钟浩，高贵宾，潘雁红，等.部分茶竿竹亚属竹种亲缘关系的荧光AFLP分析[J].江西农业大学学报，2015，37(6)：1033-1036.