高效液相色谱法测定猴头菇中4种核苷含量

文 / 钟倩霞（无限极（中国）有限公司 广州 广东510030）

高效液相色谱法测定猴头菇中4种核苷含量

文 / 钟倩霞（无限极（中国）有限公司 广州 广东510030）

目的：运用高效液相色谱法分析猴头菇中尿苷、肌苷、鸟苷、腺苷的含量。方法：色谱条件为：Grace Prevail Select C18 (4.6×150mm, 5☒m)分析柱；流动相为A(水)-B(甲醇)二元梯度洗脱，梯度为：0～4.0min，B%为0→2%；4.0～10.0min，B%为2%→10%；10.0～16.0min，B%为10%→95%；16.0～20.0min，B%为95%→100%；20.0～25.0min，B%为100%→100%；柱温25℃；进样量10μL；流速1mL・min-1；检测波长254nm。结果：尿苷、肌苷、鸟苷和腺苷分别在2.0～181.0μg・mL-1（r=1.0000）、1.5～190.0μg・mL-1（r=0.9999）、0.8～126.4μg・mL-1（r=0.9999）和1.0～171.2 μg・mL-1（r=1.0000）范围内线性关系良好。加样回收率（n=3）分别为99.5%（RSD=2.8%）、100.5%（RSD=3.2%）、98.9%（RSD=3.4%）和98.1%（RSD=3.7%）。三个产地猴头菇的核苷含量差异比较大，浙江江山猴头菇的尿苷、鸟苷、腺苷含量是所测样品中最高的，分别为：1.44mg・g-1、1.06mgμg-1和2.72mg・g-1，猴头菇中肌苷含量极低，仅在浙江常山和福建莆田产猴头菇中检出，浙江江山猴头菇未检出。结论：本法能够快速、简便地测定猴头菇中主要核苷的含量，为其质量控制提供保证。

高效液相色谱；猴头菇；核苷

猴头菇（Hericium erinaceus）隶属于担子菌门，猴头菌科，是名贵的药食两用真菌。其性平、味甘，具有助消化、利五脏的功能。猴头菇主要化学成分为甾醇、脂肪酸、猴头菌素、猴头菌酮及多糖，猴头菇多糖是其主要活性物质之一，具有增强机体免疫力，抗氧化，抗衰老，降血糖，以及治疗胃炎胃溃疡等活性[1]。核苷是生物细胞维持生命的重要物质，是半必需营养素—核苷酸的重要组成部分[2]，也被认为是补益中药共有的物质基础[3-5]。目前，对猴头菇中的核苷类成分的分析还未见文献报道。本文采用高效液相色谱法同时检测了猴头菇中的尿苷、肌苷、鸟苷和腺苷，并对不同来源的3个猴头菇中核苷类成分的含量进行了比较。

1、仪器与试药

1.1 仪器

药材粉碎机（旗箭，上海）、加压溶剂提取仪（Dionex, Sunnyvale , CA, USA）、Agilent 1200高效液相色谱系统，包括自动进样器、在线脱气机、四元梯度泵、柱温箱和DAD检测器（Agilent，美国）。

1.2 试剂

尿苷、肌苷、鸟苷和腺苷均购自Sigma公司；甲醇（色谱纯，Merk，德国）和水（Millipore超纯水系统，美国）猴头菇子实体分别采自浙江江山、浙江常山、福建莆田，经鉴定为Hericium erinaceus（Bull.: Fr.）Pers.。

2、方法与结果

2.1 色谱条件

Grace Prevail Select C18分析柱（4.6×150 mm, 5☒m）；流动相为A（水）-B（甲醇）二元梯度洗脱，梯度为：0～4.0min，B%为0→2%；4.0～10.0min，B%为2%→10%；10.0～16.0min，B%为10%→95%；16.0～20.0min，B%为95%→100%；20.0～25.0 min，B%为100%→100%。柱温25℃；进样量10μL；流速：1mL・min-1；检测波长254nm。

2.2 对照品储备液的制备

准确称取对照品尿苷9.70mg、肌苷9.56mg、鸟苷6.35mg和腺苷9.36mg，分别置于10mL容量瓶中，用水溶解并稀释至刻度，摇匀，制得对照品储备液。

2.3 样品制备

称取猴头菇粉末0.5g，与硅藻土1:1混匀，至11mL提取管中，以纯水为溶剂，160℃，5min，1500psi条件下提取，提取液离心，取上清液转移至25mL容量瓶中纯水定容，精密量取5mL氮吹浓缩，再转移至1mL容量瓶中用纯水定容，过膜备用。

2.4 线性关系考察

分别准确量取尿苷、肌苷、鸟苷和腺苷的对照品储备液适量制成混标，加水稀释成6个浓度的系列对照品混合溶液，以0.45μm微孔滤膜过滤后供HPLC分析。以各对照品峰面积Y对浓度X（μg・mL-1）进行线性回归。尿苷、肌苷、鸟苷和腺苷的回归方程及最低检测限（LOD，S /N=3）和最低定量限（LOQ，S / N=10）见表1。

表1 尿苷、肌苷、鸟苷和腺苷的线性范围及检测限和定量限Table1 Regression data, limit of detection and limit of quantification of uridine, inosine, guanosine and adenosine

2.5 精密度考察

取同一份对照品混合溶液，同一天连续进样6次，计算各峰面积，考察日内精密度；每天进样2次，连续测定3天，计算各峰面积，考察日间精密度。结果尿苷、肌苷、鸟苷和腺苷的日内精密度RSD（n=6）分别为0.42%、0.59%、0.63%和0.48%；日间精密度RSD（n =6）分别为2.54%、3.05 %、1.62 %和2.66 %。

2.6 重复性考察精密称取同一猴头菇样品粉末0.30g、0.40g、0.50g各3份，按2.3项下方法制备供试品溶液，分别测定，计算峰面积，结果RSD分别小于3.1%、2.5%和1.8%。

2.7 加样回收率考察称取已知含量的猴头菇粉末6份，每份约0.25g，按各成分在原药材中的含有量分别精密加入等量的对照品，按2.3项下方法制备供试液，测定并计算加样回收率。结果尿苷、肌苷、鸟苷和腺苷的平均加样回收率和RSD分别为99.5%（RSD=2.8%）、100.5%（RSD=3.2%）、98.9%（RSD=3.4%）和98.1%（RSD=3.7%）。

2.8 不同来源猴头菇中核苷类成分含量测定

按照2.3方法制备供试品溶液，用外标法测定不同来源的猴头菇中的尿苷、肌苷、鸟苷和腺苷含量，HPLC谱图如图1所示，含量的测定结果见表2。

图1 HPLC分析猴头菇中4种核苷色谱图A，混合对照品；B，浙江江山猴头菇样品；C，浙江常山猴头菇样品；D，福建莆田猴头菇样品Figure 1 HPLC chromatograms of investigated samples A, Mixed standards; B, C and D, Sample of Hericium erinaceus from Zhejiang Jiangshan, Zhejiang Changshan and Fujian Putian, respectively

表2 3个产地猴头菇中尿苷、肌苷、鸟苷和腺苷的含量（mg・g-1）Table 2 Contents(mg・g-1)of uridine, inosine, guanosine and adenosine in Hericium erinaceus

3、讨论

3.1 提取方法的选择

猴头菇在日常生活中多以水煮熬汤的方式食用，且核苷类成分水溶性良好，故本实验选用水作为提取溶剂。提取技术是中药质量控制的关键，目前常用的提取方法有索氏提取法、超声提取法、回流提取法等。但这些提取方法或多或少的存在一些不足之处，如：提取时间较长、溶剂消耗量较高、提取效率较低。加压溶剂提取技术具有的提取快速、效率高、节约溶剂以及自动化等优点，具有很高的重现性，可有效降低提取条件差异带来的实验误差。

3.2 色谱条件的优化

本实验比较了不同型号的色谱柱对核苷类成分的分离效果，包括Agilent SBC18，Agilent Bonus-RP，Agilent Eclips XDB C18和Grace Prevail select C18。结果显示，Grace Prevail select C18在甲醇-水体系下即可对4种核苷类成分有良好的分离，峰型也未见明显拖尾，且该型号的色谱柱在高水相流动相下有良好的柱寿命及稳定性，适合核苷类成分的分离。此外，该色谱条件还同时兼顾了真菌特征成分—麦角甾醇的分离，可同时测定猴头菇中核苷和麦角甾醇含量。

3.3 不同产地猴头菇中核苷含量的差异

从表2可以看出，不同产地的猴头菇，4种核苷的含量均存在较大差异，其中尿苷、鸟苷、腺苷3个成分含量，按高低依次为：浙江江山＞浙江宝新＞福建莆田。而肌苷的含量在所有猴头菇样品中均较低，含量依次为：浙江常山＞福建莆田，而浙江江山猴头菇的肌苷含量低于定量限。不同猴头菇中核苷类成分的含量差异与产地或采收时间的关系，值得进一步深入研究。

[1] Editorial Board of China Herbal, State Administration of Traditional Chinese Medicine, China. China Herbal（中华本草）[M]. Shanghai: Shanghai Scientific and Technical Publishers, 1999.

[2] MartinezAugustin O., Boza JJ., Navarro J., et al. Dietary nucleotides may influence the humoral immunity in immunocompromised children. Nutrition, 1997, (5): 465.

[3] ZHANG Yuan-jie(张元杰), QIAN Zheng-ming(钱正明),CHEN Xiao-jia(陈肖家), et al. Simultaneous HPLC determination of uridine, adenine, guanosine, and adenosine in six tonic traditional Chinese medicine（HPLC法同时测定补益中药中尿苷、腺嘌呤、鸟苷和腺苷的含量）. Chin J Pharm Anal (药物分析杂志), 2010, 30(1): 33

[4] Yang F Q, Li S P, Li P, et a1.Optimization of CEC for simultaneous determination of eleven nucleosides and nucleobases in Cordyeeps using central composite design. Electrophoresis, 2007, 28(11): 1681.

[5] Gao J L, Wang Y T, Li S P, et a1. Qualitative and quantitative analyses of nucleosides and nucleobases in Ganoderma spp. by HPLCDAD-MS. J Pharm Biomed Anal, 2007, 44(3): 807.

HPLC Determination of 4 Nucleosides in Hericium erinaceus from Different Regions

ZHONG Qian-xia
Infinitus (China) Company Limited, Guangzhou, Guangdong, 510030;

Aim: To determine nucleosides (uridine, inosine, guanosine and adenosine) in Hericium erinaceus by HPLC-DAD. Method: Grace Prevail Select C18 (4.6×150 mm, 3☒m) column was used for simultaneous determination of uridine, inosine, guanosine and adenosine in D. echinovolvata. Gradient elution with solvent A (water) and B (methanol) was performed as: 0-4.0 min，0→2%B；4.0-10.0min，2%→10%B；10.0-16.0 min，10%→95%B；16.0-20.0 min，95%→100%B；20.0-25.0 min，isocratic 100%B. The flow rate was 1 mL・min-1and the injection volume was 10μL. The system operated at 25 ℃ and the 4 nucleosides were monitored and quantified at 254 nm. Result: Uridine, inosine, guanosine and adenosine showed good linearity in the ranges of 2.0-181.0μg・mL-1(r=1.0000), 1.5-190.0μg・mL-1(r=0.9999), 0.8-126.4 μg・mL-1(r=0.9999) and 1.0-171.2 μg・mL-1(r=1.0000), and the average recoveries (n=3) were 99.5% (RSD=2.8%), 100.5% (RSD=3.2%), 98.9% (RSD=3.4%) and 98.1% (RSD=3.7%), respectively. The contents of investigated nucleosides were differ from different regions of Hericium erinaceus The contents of uridine, guanosine and adenosine in Hericium erinaceus from Zhejiang jiangshan was the highest among the 3 samples, and the content of uridine, guanosine and adenosine was 1.44 mg・g-1, 1.06 mg・g-1and 2.72 mg・g-1, respectively. However, the content of inosine was very low in investigated Hericium erinaceus, the samples from Zhejiang Changshan and Fujian Putian could be detected and Zhejiang Jiangshan could not be detected. Conclusion: High performance liquid chromatography established in this study is a rapid and simple method for simultaneous determination of nucleosides in Hericium erinaceus and helpful to its quality control.

high performance liquid chromatography; Hericium erinaceus; nucleosides