树突状细胞共培养因子诱导的杀伤细胞联合化疗治疗中晚期非小细胞肺癌的临床疗效

罗敏 张娟 薛军

树突状细胞共培养因子诱导的杀伤细胞联合化疗治疗中晚期非小细胞肺癌的临床疗效

罗敏 张娟 薛军

目的探讨树突状细胞与细胞因子诱导的杀伤细胞共培养对细胞因子诱导的杀伤细胞的作用及两者共培养后联合化疗药物奥沙利铂对中晚期非小细胞肺癌的体外杀伤效果。方法取非小细胞癌患者的恶性胸腔积液并采取密度梯度离心法获得树突状细胞，体外诱导获得成熟的树突状细胞;分离健康人的单核细胞，体外培养获取杀伤细胞;两者共培养后流式细胞鉴定表型，采用MTT法检测中晚期非小细胞肺癌的体外杀伤作用。结果恶性胸腔积液内树突前体细胞经过体外培养之后获得了成熟的树突细胞，培养9天以后获得树突细胞表明标志物CD83、CD80、CD86和MHC-II相关分子HLA-DR比培养前显著增高(P＜0．05);培养2周之后树突细胞和杀伤细胞共培养与杀伤细胞单独培养比较CD3+、CD4+、CD8+数量明显增加，组间比较具有统计学差异(P＜0．05)。树突细胞和杀伤细胞对中晚期非小细胞肺癌有着抑制作用，杀伤力大于单纯使用杀伤细胞组，组间比较具有统计学差异(P＜0．05)。树突细胞和杀伤细胞共培养联合化疗药物奥沙利铂对中晚期非小细胞肺癌的体外杀伤具有联合增效的作用，组间比较具有统计学差异(P＜0．05)。结论恶性胸腔积液来源的树突前体细胞可以诱导培养获得成熟的树突细胞，成熟的树突细胞联合杀伤细胞可以促进杀伤细胞的增殖及杀伤力，两者共培养联合化疗药物奥沙利铂具有协同增强中晚期非小细胞肺癌的体外杀伤作用。

树突细胞;细胞因子;杀伤细胞;化疗药物;非小细胞肺癌

(The Practical Journal of Cancer，2015，30:1112～1115)

肺癌是致死率较高的恶性肿瘤之一，发病率呈逐年上升的趋势，非小细胞肺癌约占肺癌的70%以上，

且大多确诊时已经是中晚期，常并发恶性的胸腔积液。目前对并发恶性胸腔积液的非小细胞肺癌的临床治疗效果有限，生存率低［1］。肿瘤的生物治疗是医学生物学和免疫学相关学科，通过增强机体的免疫功能达到抑制恶性肿瘤的作用，近年来个体化综合化治疗已经成为治疗肺癌的治疗模式，生物治疗不仅具有副作用小，同时能够起到协同杀伤肿瘤细胞的作用，给肿瘤治疗带来了新的治疗希望，但目前生物治疗和化疗联合应用模式还处于探讨阶段［2-3］。树突状细胞和杀伤细胞作为生物学治疗的重要方式，研究已发现两者联合治疗取得了一定的治疗效果，但是与化疗药物的联合应用情况仍在探索阶段［4］。本研究旨在探讨通过恶性胸腔积液体外培养获得成熟树突细胞，并与外源性的杀伤细胞共培养后，联合化疗药物奥沙利铂对中晚期非小细胞肺癌的体外肿瘤细胞杀伤作用，为该疾病的临床治疗提供理论依据。

1 材料与方法

1．1 材料

纳入我院2013年1月至2014年11月我院经过纤支镜、经皮穿刺、痰液、淋巴穿刺等方法确诊为中晚期非小细胞肺癌患者50例，收集每例患者的800 ml胸腔积液，同时收集我院体检中心体检的健康人群外周血200 ml。

1．2 仪器和试剂

培养基采用PRMI1640(美国GⅠBCO公司)，含血清的完全培养基(美国Santa Cruz公司)，重组人巨噬细胞集落刺激因子(美国灵葆雅公司)，白细胞介素-4、肿瘤坏死因子α(上海硕盟生物)，CD83、CD80、CD86和MHC-II相关分子HLA-DR(武汉博士德)，CD3+、CD4+、CD8+(美国Santa Cruz公司)，干扰素-γ、白细胞介素-2(上海碧云天生物)，淋巴细胞分离液(中国科学院血液研究所)，中晚期非小细胞肺癌细胞系(中国科学院细胞库)，MTT试剂盒(美国GⅠBCO公司)，酶联免疫仪(德国BiofugeStratos)，倒置显微镜(日本奥林巴斯)，流式细胞仪(澳大利亚Rotorgene)。

1．3 研究方法

1．3．1 恶性胸腔积液获取树突前体细胞收集恶性胸腔积液，离心之后取上清，通过淋巴细胞分离液将细胞悬液分析，并将细胞悬液和淋巴细胞分离液混合离心20 min，2 000 r/min，对层间液进行收集，并重悬之后种于细胞培养6孔板中，在标准37℃，5%的CO2培养箱内培养10 min，取悬浮细胞，丢弃贴壁细胞，再在6孔板中培养2 h后，去除悬浮细胞，洗涤培养板，去除上清后，加入含有白细胞介素-4、重组人粒巨噬细胞集落刺激因子、含双抗的10%以上的胎牛血清培养基，每3天进行一次换液，同时补充以上细胞因子继续培养，9天的时候收集树突细胞。

1．3．2 杀伤细胞的培养纳入我院同一时期体检科检查的健康人群外周血，离心分离获得外周血的单核细胞，6孔板中培养2 h，收集未贴壁细胞，继续使用培养基培养，同时加入干扰素-γ、第2天加入CD3，第3天加入白介素-2，同样每3天进行一次细胞换液，加入细胞因子。

1．3．3 杀伤细胞联合树突细胞共培养树突细胞和杀伤细胞培养，按照1∶5的比例混合，共培养2周，并进行每3天进行一次细胞换液，加入细胞因子。

1．4 检测方法

1．4．1 细胞表型检测应用流式细胞仪在培养前及培养9天时对树突细胞的表面标记物CD83、CD80、CD86和MHC-II相关分子HLA-DR进行检测，培养14天的时候对杀伤细胞和树突细胞-杀伤细胞的表明标志物CD3+、CD4+、CD8+进行检测。

1．4．2 树突细胞-杀伤细胞共培养之后对其杀伤力检测通过调整中晚期非小细胞癌的培养浓度，让其成为研究的靶细胞，运用杀伤细胞和树突细胞-杀伤细胞去干预其效应，干预的浓度调整为5∶1，10∶1和20∶1，培养24 h之后采用MTT法对其杀伤力进行检测，统计杀伤率。

1．4．3 运用MTT法检测杀伤细胞和树突细胞-杀伤细胞联合化疗药物奥沙利铂对中晚期非小细胞癌体外的杀伤效果调整中晚期非小细胞癌的浓度至6孔板100 μl，24 h贴壁生长之后加入化疗药物奥沙利铂，再24 h之后加入5∶1，10∶1和20∶1树突细胞-杀伤细胞，同时设立对照组，共培养24 h之后采用MTT法对其联合的杀伤活性进行检测。

1．5 统计学方法

所有收集的数据资料均妥善存档，采用SPSS 21．0统计软件对数据做统计分析。本研究中计量资料数据正态分布资料采用(±s)表示，非正态分布资料采用中位数表示。遵循正态分布而且方差齐性，故组间的比较采用独立样本t检验，百分率的比较采用χ2检验，P＜0．05具有统计学意义。

2 结果

2．1 树突细胞的表面标志物检测

通过流式细胞仪的检测方法对培养9天之后的成熟树突细胞的表面标志物CD83、CD80、CD86和MHCII相关分子HLA-DR进行检测，结果显示，培养9天以后获得树突细胞表明标志物比培养前显著增高，比较差异具有统计学意义(P＜0．05)，见表1。

表1 树突细胞的表面标志物检测(±s，%)

表1 树突细胞的表面标志物检测(±s，%)

注:①为与培养前相比，P＜0．05。

CD83CD80CD86HLA-DR培养前14．87±5．38①18．85±9．35①20．32±6．25①41．82±8．38组别①培养9天56．87±17．3858．86±14．0960．12±13．0370．87±16．38 t 0．0000．0000．0000．000 12．12623．4588．0456．965 P

2．2 表面标志物CD3+、CD4+、CD8+的检测

培养14天的时候对杀伤细胞和树突细胞-杀伤细胞的表面标志物CD3+、CD4+、CD8+进行检测，结果显示，培养14天之后树突细胞和杀伤细胞共培养与杀伤细胞单独培养比较CD3+、CD4+、CD8+数量明显增加，组间比较具有统计学差异(P＜0．05)，见表2。

表2 表面标志物检测(±s，%)

表2 表面标志物检测(±s，%)

78．87±12．3530．85±6．3567．38±16．25树突细胞和杀伤细胞共培养83．85±12．5838．86±8．0973．15±18．03 t CD3+CD4+CD8+杀伤细胞组别8．8647．7826．237 P 0．0000．0000．000

2．3 树突细胞-杀伤细胞共培养之后对中晚期非小细胞肺癌杀伤力

通过调整中晚期非小细胞肺癌的培养浓度，让其成为研究的靶细胞，运用杀伤细胞和树突细胞-杀伤细胞去干预其效应，结果显示，树突细胞-杀伤细胞对中晚期非小细胞癌有着抑制作用，杀伤力大于单纯使用杀伤细胞组，组间比较具有统计学差异(P＜0．05)，见表3。

表3 树突细胞-杀伤细胞共培养之后对中晚期非小细胞癌杀伤力(±s，%)

表3 树突细胞-杀伤细胞共培养之后对中晚期非小细胞癌杀伤力(±s，%)

注:①为与杀伤细胞相比，P＜0．05。

14．58±2．3519．45±1．4529．72±1．25树突细胞-杀伤细胞共培养26．85±2．10①34．86±2．59①49．53±3．03①t杀伤细胞干预浓度5∶110∶120∶1杀伤细胞组别树突细胞-0．0000．0000．000 19．45315．35713．575 P

2．4 运用MTT法检测杀伤细胞和树突细胞-杀伤细胞联合化疗药物奥沙利铂对中晚期非小细胞癌体外的杀伤效果

加入不同剂量的化疗药物奥沙利铂，再24 h之后加入5∶1，10∶1和20∶1树突细胞-杀伤细胞，共培养24 h之后采用MTT法对其联合的杀伤活性进行检测，结果显示，单独使用奥沙利铂对中晚期非小细胞肺癌的体外杀伤作用随着浓度的增加而增加(P＜0．05)，树突细胞-杀伤细胞对中晚期非小细胞肺癌的体外杀伤作用同样随着浓度的增加而增加(P＜0．05)，联合使用奥沙利铂及树突细胞-杀伤细胞起到联合增强的作用，见表4。

3 讨论

肺癌已经成为全球死亡率最高的肿瘤之一，发病率居所有的恶性肿瘤首位，据统计每年的新发死亡病例是恶性肿瘤之首，其中非小细胞肺癌占肺癌总数的75%以上，多数患者确诊时已经是中晚期［5-7］。随着药物的不断发展，治疗方法也不断改善，但是其耐药性问题一直存在，治疗效果欠佳，5年的生存率不到15%，因此寻找新的治疗方法具有重要的临床意义［8］。生物反应调节的提出，给肿瘤的发展带来了一定的希望，

其是通过激活体内的自然防御功能，调节机体的正常生物反应动态平衡，以激活机体的免疫功能，达到抑制肿瘤的作用。树突细胞是目前为止在体内功能最强大的抗原提呈细胞，可以促进T细胞的免疫应答反应，调节机体的免疫应答［9］。杀伤细胞是由人体的外周血分离而来，通过体外的细胞因子诱导获得，其具有增殖迅速、抗肿瘤等特点。树突细胞和杀伤细胞是肿瘤免疫治疗的重要组成部分，通过树突细胞进行抗原的识别，激活免疫系统，通过杀伤细胞对自身分泌的毒性物质进行清除，已有研究发现两者的共培养可以增强细胞的毒性，具有更强的增殖活性［10-11］。

本研究通过中晚期非小细胞癌患者的恶性胸腔积液来源的树突细胞及体外诱导培养的杀伤细胞进行共同培养，通过细胞的表型鉴定发现恶性胸腔积液内树突前体细胞经过体外培养之后获得了成熟的树突细胞，培养9天以后获得树突细胞表明标志物CD83、CD80、CD86和MHC-II相关分子HLA-DR比培养前显著增高;培养2周之后树突细胞和杀伤细胞共培养与杀伤细胞单独培养比较CD3+、CD4+、CD8+数量明显增加;树突细胞-杀伤细胞对中晚期非小细胞癌有着抑制作用，杀伤力大于单纯使用杀伤细胞组。结果表明了联合使用对中晚期非小细胞癌具有更强的杀伤作用，有利于醋精两者的作用的协同效应。

随着肿瘤研究的不断发展，研究发现个体化的综合治疗方法运用是一种新的治疗模式，已成为肿瘤治疗的重要趋势，化疗药物的应用在临床中已取得了公认的治疗效果，其细胞毒性对于杀伤机体活跃的细胞，对机体免疫力的调节具有动摇的作用，但是化疗药物又有其局限性，不利于抗肿瘤的免疫应答，不能有效的清除处于休眠期的肿瘤细胞，使患者病情反复，且使用后也容易出现耐药的发生［12-13］。研究发现生物治疗联合化疗的综合治疗方法在临床实践中具有较好的治疗效果，可以诱发机体的多种免疫防疫体系，对于休眠期细胞具有彻底的杀伤作用，有效提高肿瘤化疗药物的敏感性，抵抗耐药作用［14］。铂类化疗药物作为非小细胞癌的治疗主要药物，其在药动学和毒理学上与之前的化疗药物有一定改进，最为明显的差别就是不产生交叉耐药，其可以通过DNA为靶点，抑制其复制，可诱导肿瘤细胞的免疫原性反应，促进肿瘤细胞的凋亡，且这些免疫原物质可以通过树突细胞的表明受体进行呈递，激活机体对肿瘤细胞的免疫应答反应［15］。本研究结果显示，树突细胞和杀伤细胞共培养联合化疗药物奥沙利铂对中晚期非小细胞肺癌的体外杀伤作用明显高于未联合组，结果提示了化疗药物奥沙利铂联合树突细胞和杀伤细胞对中晚期非小细胞肺癌具有更好的杀伤作用，这也给肿瘤化疗及生物免疫资料的临床应用提供了一定理论基础。

综上所述，通过本研究可以看出化疗药物奥沙利铂联合树突细胞和杀伤细胞对中晚期非小细胞肺癌具有更好的治疗效果，更重要的是联合应用之后可以大大减少化疗药物的使用剂量，在一定程度上减轻了化疗药物对机体产生的不良反应，对患者的治疗起积极的作用。由于体外研究与应用于临床还有一段路要走，期待有更多的研究在此基础上不断完善。

表4 杀伤细胞和树突细胞-杀伤细胞联合化疗药物对中晚期非小细胞癌体外的杀伤效果［(±s)，%］

表4 杀伤细胞和树突细胞-杀伤细胞联合化疗药物对中晚期非小细胞癌体外的杀伤效果［(±s)，%］

=0．000树突细胞-杀伤细胞组间比较F=89．210P=0．000奥沙利铂-树突细胞-杀伤细胞组间比较F=71．153P组别树突细胞-杀伤细胞干预浓度26．88±1．8434．52±2．5549．53±2．98奥沙利铂(12．5 μg/ml)2．86±1．1530．76±1．7540．52±2．6554．54±2．54奥沙利铂(25．0 μg/ml)10．25±2．5839．87±2．9548．56±2．9562．86±4．55奥沙利铂(50．0 μg/ml)29．65±2．4560．56±3．5570．56±3．1589．84±8．65奥沙利铂组间比较F=52．153P 0∶05∶110∶120∶1奥沙利铂(0．0 μg/ml)0 =0．000

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Clinical Efficacy of Dendritic Cells Co-cultured with Cytokine Induced Killer Cells Combined with Chemotherapy for Middle and Advanced Non-small Cell Lung Cancer

LUO Min，ZHANG Juan，XUE Jun．Daye Nonferrous Metals Corporation General Hospital，Huangshi，435005

ObjectiveTo investigate the effect of co-culture of dendritic cells and cytokine-induced killer cells on cytokine-induced killer cells，and the 2 co-cultured cells combined with oxaliplatin for advanced non-small cell lung cancer．MethodsPatients with non-small cell lung cancer and malignant pleural effusions take density gradient centrifugation dendritic cells in vitro to obtain mature dendritic cells;from healthy patients monocytes in vitro obtained killer cells;2 cells were identified by flow cytometry after co-culture phenotypes，in vitro cytotoxicity was analyzed by MTT assay in advanced non-small cell lung cancer．ResultsMalignant pleural effusion dendritic precursor cells were obtained after in vitro maturation of dendritic cells，dendritic cells cultured 9 days and showed markers CD83，CD80，CD86 and MHC-II related HLA-DR molecules than former culture were significantly higher(P＜0．05);after 2 weeks in dendritic cells co-cultured with killer cells and killer cells cultured alone，CD3+，CD4+，CD8+number increased significantly，there had statistically significant difference(P＜0．05)between groups．Dendritic cells-killer cells in patients with advanced non-small cell lung cancer had inhibited the use of lethal than simply killer cells，there had statistical difference(P＜0．05)．Dendritic cells co-cultured with killer cells in combination with oxaliplatin for advanced non-small cell lung cancer has the effect of killing in vitro，there had statistically difference(P＜0．05)．ConclusionMalignant pleural effusion derived dendritic cell precursors can induce mature dendritic cells cultured，mature dendritic cells combined with killer cells can promote the proliferation and lethal of killer cells，combined with oxaliplatin can enhancement killing effect of advanced non-small cell lung cancer．

Dendritic cells;Cytokines;Killer cells;Chemotherapeutic drug;Non-small cell lung cancer

10．3969/j．issn．1001-5930．2015．08．002

R734．2

A

1001-5930(2015)08-1112-04

2015-05-08

2015-07-09)

(编辑:甘艳)

湖北省自然科学基金面上项目(2012FFB02423)

435005湖北省大冶有色金属集团公司总医院(罗敏，张娟);430022华中科技大学同济医学院附属协和医院(薛军)

薛军